АНАЛИЗ АРБУТИНА ПОДЗЕМНЫХ И НАДЗЕМНЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНОВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО (BERGENIA CRASSIFOLIA (L.)FITSCH.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА АЛТАЕ Л.М. Федосеева Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул (Россия)

Целью работы является анализ арбутина корневищ, зеленых, красных и бурых листьев бадана толстолистного. В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной, высокоэффективной жидкостной хроматографии, фотоэлектроколориметрического и спектрофотометрического определения проведена идентификация и установлено количественное содержание арбутина, которое составило в корневищах 6,46%, зеленых листьях – 15,53%, красных – 7,69%, бурых – 4,43%.

Введение
Бадан толстолистный – вечнозеленый травянистый многолетник, высота 10–60 см, с мощным ветвистым горизонтальным мясистым корневищем, имеющем 1–2 см в поперечнике, длина до 2 м, густо покрыто, особенно в верхней части, остатками черешков отмерших листьев. Верхушка корневища и его ветвей дает ежегодную розетку листьев и один цветоносный стебель. Листья в количестве от 1 до 12 – прикорневые, длинночерешковые, кожистые, на верхней стороне блестящие, на нижней стороне с точечными железками. Они широкоэллиптические или почти округлые, при основании сердцевидные, край редко зубчатый; длина листовой пластины 3–35 см, ширина 2,5–30 см [1].
Поскольку бадан развивается несколько лет, на одном растении находятся бурые, красные и зеленые листья.

Бадан толстолистный – одно из немногих растений, содержащих комплекс фенольных соединений, значительное количество которого составляет арбутин (до 22%) [2]. Арбутин – n-гидроксифенил-Dглюкопиранозидон, является фенологликозидом [3].
Первые сведения о природе арбутина появились в 1762 г., когда Модел выделил химически чистое и фармакологически активное вещество из листьев толокнянки. Из бадана арбутин впервые выделен А.Е. Чичибабиным с сотрудниками в 1931 г., где он содержится в свободном состоянии, а в листьях толокнянки и брусники в виде метиларбутина [4].
Арбутин представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 199–200° С, растворяется в воде и этиловом спирте, не растворяется в этиловом эфире, хлороформе [3]. Как все фенольные гликозиды, арбутин оптически активен в связи с присутствием в молекуле глюкозы. Арбутин – О-гликозид, характеризуется способностью к ферментативному и кислотному гидролизу, при сухой перегонке расщепляется на гидрохинон и глюкозу [5].
Целью настоящей работы является качественное и количественное определение арбутина в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана толстолистного.
Объектом исследований служило сырье, собранное в республике Алтай в 1996–2001 гг.

Экспериментальная часть
Для идентификации арбутина использовали цветные реакции, хроматографические методы анализа.
Качественный анализ арбутина проводили с водными вытяжками из сырья. В качестве контроля использовали раствор арбутина-стандарта (РСО).
ГФ Х1 издания ст. 26 «Листья толокнянки» регламентирует реакции на арбутин с сульфатом закисного железа и фосфорномолибденокислым натрием [6].
Реакции взаимодействия арбутина с сульфатом закисного железа и натрия фосфорномолибденокислым
имеют недостатки, так как соли железа образуют комплексные соединения с полифенолами, а содержание
в бадане дубильных веществ мешает определению арбутина. Изучалась возможность проведения реакций
до и после осаждения полифенолов ацетатом свинца.
Кроме фармакопейных реакций, предложены реакции образования антипиринового красителя (с
4-аминоантипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин.
Образование красителей связано с наличием в молекуле арбутина фенольного гидроксила [7–9].
Хроматография на бумаге водных извлечений осуществлялась восходящим методом на быстро
фильтрующей бумаге марки «Filtrak» и FN-3 типа медленная и быстрая; хроматография в тонком слое
сорбента – на пластинках «Silufol» в системах растворителей: 1 – раствор уксусной кислоты 15%, 2 –раствор уксусной кислоты 60%, 3 – этилацетат – муравьиная кислота – вода (3 : 1 : 1).
Последующую идентификацию арбутина осуществляли, используя высокоэффективную жидкостную
хроматографию и спетрофотометрию. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые
извлечения пропускали через колонку с оксидом алюминия ΙΙ степени активности. Измеряли спектры
элюата на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».
Количественное определение арбутина проводили йодометрическим методом титрования [6],
фотоэлектроколориметрическим методом, в основе которого лежит реакция образования азокрасителя с
диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий) [7], cпектрофотометрическим методом,
основанном на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения
антипиринового красителя [10–12].
Обсуждение результатов
В результате эксперимента установлено, что сульфат железа (ΙΙ) с испытуемыми растворами до осаждения полифенольных соединений давал черно-синюю окраску, аналогично гидролизуемым дубильным веществам. После осаждения образовалась голубая окраска растворов, как и у арбутина-стандарта.
Натрий фосфорномолибденовокислый давал синюю окраску испытуемых растворов до и после осаждения полифенолов.
Проводились реакции образования антипиринового красителя (с 4-амино-антипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин.
Определена чувствительность реакций для обнаружения арбутина в лекарственном сырье. Готовили серию стандартных разведений с концентрацией от 300 до 12,5 мкг/мл. Из данных которой следует, что чувствительность реакции с натрий фосфорномолибденовокислым составила 12,5 мкг/мл, с 4-аминоантипирином – 25 мкг/мл, с реактивом Паули – 50 мкг/мл. Наибольшей чувствительностью обладала реакция с натрием форфорномолибденовокислым.

В результате хроматографирования на бумаге в видимом свете пятен исследуемого вещества и
«свидетеля» не обнаружено. В УФ-свете пятна бледно-фиолетового цвета. Значения Rf рассчитывали после
проявления хроматограмм реактивом Паули – красные пятна. Проявляющиеся пятна исследуемого
вещества и «свидетеля» по цвету и значениям Rf совпадали (табл. 3). В системе уксусная кислота 15% Rf =0,87; уксусная кислота 60% Rf = 0,84; этилацетат – муравьиная кислота – вода (3 : 1 : 1) Rf = 0,90 – самое
высокое значение. Эта система растворителей обладала хорошей разделяющей способностью и
воспроизводимостью результатов.
В результате проведения хроматографии в тонком слое сорбента в Уф-свете наблюдали фиолетовую флуоресценцию пятен на пластинах в системе: 60% уксусная кислота. Хроматограмму проявляли реактивом Паули. Зона вещества исследуемых извлечений и арбутина- стандарта совпали, величина Rf = 0,88±0,01. В системе 1 и 3 разделение веществ не происходило.
Наличие в молекуле арбутина остатка гидрохинона с достаточной сопряженной системой предполагает поглощение света определенной длины волны с максимумом поглощения при λ = 220 в УФ-области, поэтому для идентификции арбутина использовали спектрофотометрические методы.
Предварительно водное извлечение освобождали от примесей. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые извлечения через колонку с оксидом алюминия ΙΙ степени активности.
Измеряли спектры элюата и арбутина-свидетеля на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».
В результате получили спектры исследуемых элюатов и раствора арбутина-свидетеля, идентичные по конфигурации кривой и положению максимумов и минимумов. Для УФ-спектра арбутина характерно два максимума поглощения при λ = 220 и 284 нм. По данным литературы для спектра арбутина характерен максимум поглощения при λ = 220 нм [11]. Нами подтверждено наличие двух максимумов поглощения арбутина в УФ-области с помощью ВЭЖХ и спектрофотометрии.
Для количественного определения арбутина ГФ Х1 (ст. 26 «Листья толокнянки») рекомендует йодометрический метод титрования [6].
Листья и корневища бадана помимо арбутина содержат свободный гидрохинон, дубильные вещества, флавоноиды, аскорбиновую кислоту. Мы полагаем, что йодометрическое определение арбутина бадана малоспецифично, поскольку после осаждения полифенольных соединений основным ацетатом свинца в извлечении остаются вещества, способные легко окисляться йодом (гидрохинон, катехины, аскорбиновая кислота и др.).

При титровании арбутина раствором йода точка эквивалентности устанавливается визуально по
изменению окраски индикатора, что может привести к ошибке. Кроме того, фармакопейный метод
определения арбутина длителен (занимает около 5 ч).
С учетом изложенного проведены исследования возможности применения для количественного
определения арбутина бадана физико-химических методов.
Фотоэлектроколориметрический метод. В основе лежит реакция образования азокрасителя после
взаимодействия арбутина с диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий).
Количественное содержание арбутина определяли по калибровочному графику, для построения
которого использовали от 0.6 до 4,2 мл 0,03% водного раствора арбутина. Подчиненность закону Бугера-Ламберга-Бера отмечалась в диапазоне концентраций арбутина 7,9–19,8 мкг/мл. Нижним пределом
обнаружения арбутина является концентрация 6,3 мкг/мл (табл. 4).
В методике рекомендовано проводить осаждение полифенолов раствором свинца ацетата основного.
Определены потери арбутина, которые составили около 1,5% (табл. 5). Таким образом, очистка извлечения от сопутствующих полифенольных соединений раствором свинца ацетата основного влечет потери арбутина, что сказывается на результатах количественного определения фотоколориметрическим методом.
Спектрофотометрический метод основан на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя.
Методика была модифицирована: 0,5 г (т.н.) измельченного сырья помещали в колбу, приливали 50 мл воды и кипятили в течение 30 мин. После охлаждения фильтровали в мерную колбу на 100 мл. Извлечение повторяли. Объединенные вытяжки доводили водой до метки 2,5 мл раствора переносили в делительную воронку, разбавляли водой до 25 мл, прибавляли 0,3 мл 2% водного раствора 4-аминоантипирина, 1 мл аммиака, 1 мл 2% водного раствора калия феррицианида. Окрашенный продукт извлекали 10 мл хлороформа. Хлороформную вытяжку процеживали в мерную колбу на 25 мл. Операцию повторяли дважды. Объединенные хлороформные растворы доводили хлороформом до метки и измеряли оптическую плотность окрашенного продукта на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 455 нм.
Результаты количественного определения арбутина в зеленых листьях бадана по методике ГФ Х1 издания, фотоэлектроколориметрическим и спектрофотометрическим методами представлены в таблице 6, из данных которой следует, что наименьшую относительную ошибку давал спектрофотометрический метод определения арбутина 3,71%, который характеризуется точностью и простотой выполнения.
Фотоэлектроколориметрический метод давал относительную ошибку 6,54% в связи с тем, что в методике предусмотрено осаждение сопутствующих полифенольных соединений, что приводило к соосаждению и арбутина. Йодометрический метод давал завышенные результаты вследствие неспецифичности используемой реакции.
Рекомендуем для количественного определения арбутина в сырье бадана спектрофотометрический метод.
В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина в зеленых листьях составило
15,53±0,39%, красных – 7,69±0,15%, бурых – 4,43±0,17%, корневищах – 6,46±0,14%.

Выводы
В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной и высокоэффективной хроматографии, спектрофотометического метода определения в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана идентифицирован арбутин.
Модифицированы методики качественного и количественного определения арбутина в бадане толстолистном.
Модифицирована и доказана целесообразность количественного определения арбутина в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом.
В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина в зеленых листьях составило 15,53±0,39%, красных – 7,69±0,15%, бурых – 4,43±0,17%, корневищах – 6,46±0,14%.

Список литературы
1. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения (Растения-целители). 3-е изд. М., 1984. 400 с.
2. Шнякина Г.П., Седельникова В.А., Цыганкова Н.Б. О содержании арбутина в листьях некоторых растений Советского Дальнего Востока // Раст. ресурсы. 1981. Т. 17. Вып. 4. С. 568–571.
3. Краткая химическая энциклопедия. М., 1961. Т. 1. 645 с.
4. Чичибабин А.Е. Недубильные вещества экстракта корневищ бадана. Арбутин // Серия А. М.,1930. С. 23.
5. Иванов И.И. Ферментативное расщепление арбутина // Методы физиологии и биохими растений. М.; Л.,1946. С. 243–246.
6. Государственная фармакопея. 11-е изд. М., 1990. Вып. 2. 398 с.
7. Браиловская В.А., Лукьянчикова Г.И. Фотоколориметрическое определение арбутина в листьях толокнянки //Фармация. 1972. №3. С. 31–32.
8. Федосеева Л.М., Малолеткина Т.С. Выделение некоторых фенольных соединений и идентификация арбутина зеленых листьев бадана // Химия растительного сырья. 1999. №3 С. 109–111.
9. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Качественное определение арбутина в листьях бадана //Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 189–196.
10. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Количественное определение арбутина в листьях бадана //Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 196–199.
11. Китанов Г. Содержание арбутина в Arctostaphylos uva ursi из разных районов НРБ // Растит. ресурсы. 1986.№3. С. 425–428.
12. Pearl I.A., Darling S.F. Spectrometry as an aid for determining structures ol naturall glucosides // Phytochem. 1989.Vol. 7. №5. P. 831–836.