ИЗУЧЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ СБОРОВ НА ОСНОВЕ ЛИСТЬЕВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО Л.М. Федосеева, Л.Е. Кудрикова, А.А. Турчанинов, Ю.С. Сивова Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина 40, Барнаул

Целью работы являются изучение и идентификация флавоноидов, входящих в состав сборов на основе листьев бадана толстолистного. В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, тонкослойной хроматографии, спектрофотометрического определения и ВЭЖХ идентифицированы флавоноиды сбора №1: рутин, кверцетин, гиперозид, ликвиритин, апигенин; сбора №2: рутин, кверцетин, ликвиритин, апигенин, гиперозид; сбора №3: рутин, кверцетин, ликвиритин, гиперозид, апигенин. Количественное содержание суммы флавоноидов в сборах в пересчете на рутин соответственно составило 1,31±0,09%, 1,21±0,09%, 3,14± 0,03%.

Введение. На кафедре фармацевтической химии с курсами токсикологической и органической химии АГМУ разработаны сборы на основе листьев бадана толстолистного. Изучается возможность их использования в акушерской практике с целью профилактики и лечения поздних гестозов.

В состав сборов входят:
№1: листья бадана, листья мелиссы, цветки ромашки, цветки календулы, соплодия хмеля, плоды шиповника;
№2: листья бадана, цветки ромашки, цветки календулы, плоды шиповника, плоды и семена лимонника, плоды рябины обыкновенной; №3: листья бадана, плоды укропа, плоды черной смородины, корневища с корнями валерианы, цветки ромашки, цветки лабазника, соплодия хмеля, трава володушки.

Флавоноиды. Это самая распространенная группа биологически активных соединений. Им присуща высокая биологическая активность, обусловленная присутствием в молекуле фенольных гидроксилов и карбонильных групп, которые, подвергаясь различным биохимическим изменениям, принимают участие в ряде физиологических процессов. Флавоноиды оказывают мочегонное, антимикробное, противовоспалительное, противоопухолевое, капилляроукрепляющее действие [1].

В результате проведения фитохимических исследований сборов установлен комплекс фенольных соединений, состоящий из простых фенолов, флавоноидов, фенологликозидов, дубильных веществ, антраценпроизводных, кумаринов и других соединений.

Целью настоящей работы является изучение флавоноидов сборов на основе листьев бадана толстолистного.

Экспериментальная часть. Изучение флавоноидов проводили с использованием качественных реакций, бумажной и тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии [2].
Для проведения качественных реакций на флавоноиды получали спиртовые извлечения: 1,0 сбора помещали в колбу на 100 мл, заливали 50 мл 70%-ного этилового спирта, настаивали на водяной бане в течение 60 мин, охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр [3].

С целью разделения и идентификации флавоноидов проводили бумажную хроматографию на бумаге марки «Filtrak» в системах растворителей:
бутанол – кислота уксусная – вода (4 : 1 : 5);
кислота уксусная ледяная – вода (60 : 40);
кислота уксусная ледяная – вода (15 : 85);
этилацетат, насыщенный водой;
толуол – кислота уксусная – вода (50 : 2 : 48).

Тонкослойную хроматографию на пластинках «Сорбфил» и «Силуфол» в системах:
этилацетат – гексан – хлороформ – н-бутанол (40 : 30 : 20 : 10);
этилацетат – кислота муравьиная – вода (10 : 2 : 3);
этилацетат –этанол – вода (100 : 27 : 13);
этилацетат – вода – кислота уксусная (10 : 10 : 40);
этилацетат – кислота муравьиная – вода [4] (80 : 10 : 10);
этилацетат – бензол – диэтиламин (2 : 7 : 1);
ацетон – метанол – кислота уксусная ледяная (70 : 25 : 5);
кислота уксусная ледяная – ацетон – эфир петролейный (10 : 45 : 45);
ацетон –эфир петролейный – диэтиламин (2 : 7 : 1);
хлороформ – ацетон (50 : 40) [5].

Для хроматографирования готовили водное и спиртовые извлечения 1 : 5 с использованием 40 и 70%-ного этилового спирта, очищали гексаном с целью удаления липофильных примесей. Хроматографирование проводили с использованием стандартов (РСО) рутина, кверцетина, кемпферола, ликвиритина, гиперозида, ликурозида. Полученные хроматограммы высушивали при комнатной температуре и просматривали при дневном свете, затем в ультрафиолетовом свете до и после обработки 1%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия. Отмечали цвет пятен, рассчитывали Rf.

В результате установили оптимальные условия разделения флавоноидов: извлечение 70%-ным этиловым спиртом; пластинки «Сорбфил», система этилацетат – кислота муравьиная – вода (10 : 2 : 3).
Для подтверждения результатов ТСХ использовали метод спектрофотометрии. Очищенное гексаном извлечение на 70%-ном спирте наносили на пластинку, хроматографировали в системе: этилацетат – кислота муравьиная – вода (10 : 2 : 3). Обрабатывали часть хроматограммы спиртовым раствором алюминия хлорида, отмечали зоны флюоресценции. Пятна элюировали 96%-ным этиловым спиртом с необработанной части пластины, снимали спектр в интервале длин волн 200–400 нм [6].

Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на хроматографе МилиХром А-02. Исследовали флавоноиды до и после кислотного гидролиза, для чего 5,0 г сбора помещали в круглодонную колбу, экстрагировали 50 мл 70%-ного этилового спирта на кипящей водяной бане с обратным холодильником 1,5 ч, фильтровали, удаляли гексаном липофильные примеси. Для проведения гидролиза к извлечению добавляли 10 мл 0,1 н кислоты соляной, нагревали на водяной бане в колбе с обратным холодильником 1 ч, извлекали флавоноиды четырехкратной экстракцией диэтиловым эфиром по 10 мл [7]. Эфирное извлечение промывали до нейтральной реакции среды, обрабатывали натрия сульфатом с целью удаления воды, упаривали на водяной бане, остаток растворяли в 70%-ным этиловом спирте [8].

Разделение флавоноидов осуществляли на колонке 0397 Silasorb SPH 5C18 2×75мм, dp=5мкм. Подвижная фаза: трифторуксусная кислота 0,1% – этилацетат. Скорость потока 150 мкл/мин. Объем вводимой пробы 5 мкл. Детектирование проводили при длинах волн 220, 254, 300, 360 нм. Для идентификации флавоноидов готовили рабочие стандартные образцы рутина, ликвиритина, кверцетина, гиперозида, гесперидина, апигенина, ликурозида в концентрации 0,05 мг/мл.

Количественное определение флавоноидов в сборах проводили методом спектрофотометриии по реакции комплексообразования со спиртовым раствором алюминия хлорида [9].

Обсуждение результатов. На основании проведенных качественных реакций [2] с металлическим цинком в концентрированной соляной кислоте, треххлористой сурьмой, 10%-ным раствором аммиака, 1%-ным раствором ванилина в концентрированной серной кислоте, средним уксуснокислым свинцом, реактивом Вильсона [3] сделали предположение о наличии в сборах флавонолов, флавононов, флавонов, флавононолов, халконов, ауронов, 5-оксифлавонов [10].

При проведении бумажной хроматографии водного извлечения из сборов 1 : 5 и извлечений на 40 и 70%-ным этиловом спирте, очищенных гексаном, в пяти системах растворителей четкого разделения флавоноидов не происходило. Возникла необходимость осуществления тонкослойной хроматографии. В результате установили, что лучшее разделение происходит при хроматографировании спиртовых извлечений (70%-ный этиловый спирт) на пластинках «Сорбфил» в системе этилацетат – кислота муравьиная – вода (10 : 2 : 3).

Результаты проведения качественных реакций флавоноидов сборов на основе листьев бадана толстолистного

Реактив Результат реакции
Сбор №1 Сбор №2 Сбор №3
Соединения, вступающие в реакцию
Цинк и НСlк Желтая окраска Красная окраска Розовая окраска
Флавонолы, флавоны, флавононы – красное окрашивание
Треххлористая сурьма
Грязно-желтый осадок
Грязно-желтый осадок
Желтое окрашивание Флавоны – желтый или желто-оранжевый цвет
10%-ный раствор аммиака
Оранжевое окрашивание
Красное окрашивание Оранжевое окрашивание
Халконы, ауроны – красное, флавоны, флавонолы, флавононы – желтое, антоцианы – синее
1%-ный раствор ванилина в к.H2SO4
Красно-оранжевое окрашивание
Вишнево-красное окрашивание
Бурое окрашивание Катехины
Ацетат свинца
Желтый осадок Желтый осадок Серовато-желтый осадок
Флавоны, халконы, ауроны, 5-оксифлавоны – желтое окрашивание
Реактив Вильсона
Желто-зеленая флуоресценция
Желто-зеленая флуоресценция
Желто-зеленая флуоресценция
Флавоны, флавонолы, халконы – желтая флуоресценция

Результаты разделения и идентификации флавоноидов сборов на основе листьев бадана толстолистного

№ пятна
Окраска в УФ-свете
Окраска в УФ-свете после обработки алюминия хлоридом
Значение Rf пятна
λ максимальная, нм Вещество

Стандарты

1 Коричневое Красно-коричневое 0,65 258; 360 Рутин
2 Голубое Голубое 0,76 276; 312 Ликвиритин
3 Желто-зеленое 0,84 207; 258 Гиперозид
4 Коричневое Коричнево-зеленое 0,88 255; 303; 370 Кверцетин
5 Желтое Коричневое 0,93 270; 372 Кемпферол
6 Желто-зеленое Зеленое 0,95 245; 305 Ликуразид

Сбор №1
1 Желтое Желтовато-зеленое 0,09 – –
2 – Зеленое 0,37 250; 296 Флавон [7]
3 – Желтовато-зеленое 0,45 268; 360 Триоксифлавон [7]
4 Коричневое Красно-коричневое 0,65 258; 360 Рутин
5 Голубое Голубое 0,76 276; 312 Ликвиритин
6 – Желтовато-зеленое 0,84 – –
7 Коричневое Коричнево-зеленое 0,88 – –

Сбор №2
1 Желтое Желтовато-зеленое 0,10 – –
2 – Зеленое 0,37 – –
3 Желтое Желтовато-зеленое 0,52 – –
4 Коричневое Красно-коричневое 0,65 258; 360 Рутин
5 – Желтовато-зеленое 0,84 – –
6 Коричневое Коричнево-зеленое 0,88 255; 303; 370 Кверцетин

Сбор №3
1 Желтое Желтовато-зеленое 0,10 – –
2 – Желтовато-зеленое 0,29 – –
3 Коричневое Красно-коричневое 0,65 258; 360 Рутин
4 Голубое Голубое 0,76 276; 312 Ликвиритин
5 – Желтовато-зеленое 0,84 – –
6 Коричневое Коричнево-зеленое 0,88 255; 303; 370 Кверцетин
7 Желтое Коричневое 0,93 – –

Сбор №1 – обнаружено 4 пятна в УФ-свете и 7 пятен после обработки хроматограммы 1%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия в УФ-свете.
Первое пятно в УФ-свете имело желтую флуоресценцию, которая при обработке раствором алюминия хлорида перешла в желтовато-зеленую, Rf=0,09.
Второе пятно проявилось после обработки раствором алюминия хлорида – зеленая флуоресценция; Rf=0,37.
Третье пятно – после взаимодействия с раствором алюминия хлорида – желтовато-зеленая флуоресценция; Rf=0,45.

Четвертое пятно в УФ-свете – коричневая окраска, переходящая после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида в красно-коричневую; Rf=0,65. Окраска пятна и значение Rf совпали со стандартом рутина.
Пятое пятно в УФ-свете – голубая флуоресценция, которая усиливалась после обработки раствором алюминия хлорида; Rf=0,76. Окраска и значение Rf пятна совпали со стандартом ликвиритина.
Шестое пятно проявилось после обработки раствором алюминия хлорида, имело желтовато-зеленую флуоресценцию; Rf=0,84, что совпало со стандартом гиперозида.
Седьмое пятно в УФ-свете – коричневая окраска, после обработки раствором алюминия хлорида - коричнево-зеленая; Rf=0,88. Окраска и значение Rf пятна совпали со стандартом кверцетина.

Сбор №2 – обнаружено 4 пятна в УФ-свете, 6 пятен после обработки алюминия хлоридом спиртовым.
Первое пятно (Rf=0,10) имело желтую флуоресценцию, переходящую в желтовато-зеленую после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида.
Второе пятно проявилось после обработки раствором алюминия хлорида – зеленая флуоресценция. Rf=0,37.
Третье пятно в УФ-свете желтое, после обработки – желтовато-зеленое; Rf=0,52.
Четвертое пятно со значением Rf=0,65 в УФ-свете имело коричневую флуоресценцию, переходящую в красновато-коричневую после обработки раствором алюминия хлорида, что совпали со стандартом рутина.
Пятое пятно с желтовато-зеленой флуоресценцией проявилось после обработки хроматограмы спиртовым раствором алюминия хлорида. Rf=0,84. Окраска и значение Rf пятна совпали со стандартом гиперозида.
Шестое пятно с коричневой флуоресценцией, переходящей в коричнево-зеленую после обработки раствором алюминия хлорида, со значением Rf=0,88 совпало со стандартом кверцетина.

Сбор №3 – 5 пятен в УФ-свете, 7 пятен после обработки раствором алюминия хлорида спиртовым.
Первое пятно – желтая, после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида желтовато-зеленая флуоресценция; Rf=0,10.
Второе пятно проявилось после обработки раствором алюминия хлорида – желтовато-зеленая флуоресценция; Rf=0,29.
Третье пятно в УФ-свете коричневое, после взаимодействия с алюминия хлоридом – красно-коричневое, по окраске и значению Rf=0,65 совпало со стандартом рутина.
Четвертое пятно имело голубую флуоресценцию до и после обработки раствором алюминия хлорида; Rf=0,76, что совпало со стандартом ликвиритина.
Пятое пятно проявилось после обработки раствором алюминия хлорида, имело желтовато-зеленую флуоресценцию. Rf=0,84; окраска и значение Rf пятна совпали со стандартом гиперозида.
Шестое пятно со значением Rf=0,88 имело коричневую окраску в УФ-свете, переходящую в коричневато-зеленую, что совпало со стандартом кверцетина.
Седьмое пятно имело желтую флуоресценцию в УФ-свете, а после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида – коричневую. Rf=0,93; окраска и Rf пятна совпали со стандартом кемпферола.

С целью подтверждения результатов тонкослойной хроматографии проводили спектрофотометрическое исследование. Полученные спектры сравнивали со спектрами рабочих стандартных образцов и с литературными данными [6]. В результате получили спектральные кривые с максимумами абсорбции (λ макс, нм): сбор №1 – 1) 258; 360, что соответствует максимумам поглощения рутина, 2) 276; 312 (ликвиритин), 3) 268; 360 – 7,5,3 (триоксифлавон) [6], 4) 250; 296 (флавон) [6]. Сбор №2 – 1) 258; 360, что соответствует максимумам поглощения рутина, 2) 256; 303; 370 – кверцетин. Сбор №3 – 1) 258; 360, что соответствует максимумам поглощения рутина, 2) 256; 303; 370 – кверцетин, 3) 276; 312, что соответствует максимумам поглощения ликвиритина. Остальные кривые не были отнесены к конкретным веществам. 

Далее осуществляли высокоэффективную жидкостную хроматографию. Получили хроматограммы спиртовых извлечений нативных и гидролизованных флавоноидов (рис. 1 и 2), в максимуме пиков снимали спектр вещества. Параллельно хроматографировали и снимали спектры рабочих стандартных образцов в концентрации 0,05 мг/мл. Идентификацию флавоноидов проводили по времени удерживания (с учетом спектральных соотношений пиков) и спектрам. Сравнительный анализ хроматограмм спиртовых извлечений из сборов до и после кислотного гидролиза показал, что использование кислотного гидролиза позволяет достигнуть более полного разделения анализируемой группы веществ. Так, в спиртовом извлечении из сбора №1 без проведения гидролиза идентифицированы: рутин, ликвиритин, гиперозид, кверцетин, апигенин со временем удерживания 8,3; 9,0; 10,1; 13,1; 14,9 мин соответственно. В извлечении сбора №2 – рутин, ликвиритин, гиперозид, апигенин со временем удерживания 8,3; 9,0; 10,1; 14,9 мин соответственно. И в извлечении сбора №3 – рутин, гиперозид, кверцетин, апигенин со временем удерживания 8,3; 10,1; 13,1; 14,9 мин соответственно.

После проведения кислотного гидролиза пики на хроматограммах не накладываются, достигается четкое разделение агликонов флавоноидов. Во всех сборах идентифицированы кверцетин, апигенин, ликвиритин со временем удерживания 13,1; 14,9; 9,0 мин соответственно.

Количественное определение содержания флавоноидов в сборах проводили методом спектрофотометрии по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом [9]. Сумма флавоноидов в пересчете на рутин составила: сбор №1 – 1,31%±0,09; сбор №2 – 1,21% ±0,09; сбор №3 – 3,14%±0,03.

Выводы. В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии, ВЭЖХ установлено, что сборы на основе листьев бадана толстолистного содержат сумму флавоноидов.

В результате разделения и идентификации определено, что
сбор №1 содержит рутин, кверцетин, гиперозид, ликвиритин, апигенин;
сбор №2: рутин, кверцетин, ликвиритин, апигенин, гиперозид;
сбор №3: рутин, кверцетин, ликвиритин, гиперозид, апигенин.

Количественное содержание флавоноидов в пересчете на рутин составляет:
сбор №1 – 1,31%±0,09;
сбор №2 – 1,21% ±0,09;
сбор №3 – 3,14%±0,03.

Список литературы:

1. Свойства флавоноидов и их функции в метаболизме растительной клетки: Сб. научн. трудов / Под ред.Т.В. Букина. Пущино, 1986. 127с.
2. Федосеева Л.М., Тимохин Е.В. Изучение флавоноидов красных листьев бадана толстолистного (Вergenia crasifolia (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 81–84.
3. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. М., 1983. 176 с.
4. Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук Е.Г. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск, 1990. 333 с.
5. Компанцева Е.В., Айрапетова А.Ю. Идентификация и количественное определение флавоноидов в многокомпонентном лекарственном средстве кардиотонического действия // Фармация. 2000. №1. С. 40–41.
6. Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И., Казаков А.П. Физико-химические характеристики флавоноидных соединений. Ростов н/Д., 1977. 125 с.
7. Юрьев Д.В., Эллер К.И., Арзамасцев А.П. Анализ флавонолгликозидов в препаратах и БАД на основе экстракта GINKGO BILOBA // Фармация. 2003. №2. С. 7–9.
8. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация / Под ред. В.А. Багировой, В.А. Северцева. СПб., 2001. 223 с.
9. Смирнова Л.П., Первых Л.Н. Количественное определение суммы флавоноидов в цветках бессмертника песчаного // Химико-фармацевтический журнал. 1998. №6. С. 35–38.
10. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е.Е. Сироткиной. Томск, 1987. 184 с.