ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЛИСТЬЕВ ГОЛУБИКИ,БРУСНИКИ, ТОЛОКНЯНКИ, ЧЕРНИКИ И ЗИМОЛЮБКИ,ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) фенольные соединения, флавоноиды, гидроскикоричные кислоты, вересковые, арбутин Л.П. Охрименко, Г.И. Калинкина, Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2\7,Томск

Методами хроматографического анализа в листьях толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки, произрастающих в Республике Саха (Якутия), идентифицировано 5–8 флавоноидов и 2–5 гидроксикоричных кислот; установлено, что качественный состав фенольных соединений толокнянки, брусники, зимолюбки, черники и голубики несколько различен. Веществами-маркерами для всех видов являются кемпферол, лютеолин и кофейная кислота. Впервые исследован качественный состав флавоноидов и гидроксикоричных кислот голубики болотной. В данном виде преобладают кемпферол, мирицетин, кверцетин, кверцитрин, изокверцитрин, дегидрокверцетин, глюкозид кверцетина; гидроксикоричные кислоты представлены кофейной, п-кумаровой, синаповой, феруловой и хлорогеновой кислотами.

Введение. Как уже сообщалось нами ранее [1], целью работы является на основании результатов сравнительного химического исследования фенольных соединений определение возможности использования в медицинской практике листьев черники, голубики и зимолюбки, произрастающих в Республике Саха (Якутия) наравне с толокнянкой и брусникой. Установлено, что листья толокнянки, брусники, черники, голубики и зимолюбки содержат до 23% фенольных соединений, представленных арбутином, флавоноидами, фенолокислотами, кумаринами и дубильными веществами. Максимальное содержание арбутина установлено в листьях зимолюбки (10–12%), в остальных видах – 4–8%, что дает возможность считать их перспективными для решения поставленной задачи. Продолжая данное исследование, немаловажной задачей считаем изучение качественного состава таких фенольных соединений, как флавоноиды и фенолокислоты.

Экспериментальная часть. Объектами исследования явились листья толокнянки (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. – толокнянка обыкновенная сем. Ericaceae), брусники (Vaccinium vitis-idaea (L.) – брусника обыкновенная, сем. Ericaceae), черники (Vaccinium myrtillus (L.) – черника обыкновенная, сем. Ericaceae), голубики (Vaccinium uliginosum (L.) – голубика болотная, сем. Ericaceae) и зимолюбки (Chimaphila umbellata (L.) W. Barton – зимолюбка зонтичная, сем.Pyrolaceae). Для проведения исследований использовали образцы, собранные в Республике Саха (Якутия) [1].

Для установления качественного состава фенольных соединений из сырья экстракцией на водяной бане при t=60–70 ºС получали экстракты на 70% этаноле (соотношение сырья и экстрагента 1 : 10). Экстракты сгущали под вакуумом и подвергали хроматографическому разделению на бумаге марки «ЛМ» и «FN-12» в системе растворителей: 1-е направление – 15% уксусная кислота, 2-е направление – н-бутанол – уксусная кислота – вода (БУВ) в соотношении 4 : 1 : 2. Детектирование фенольных соединений на хроматограммах проводили в УФ-свете до и после проведения качественных реакций со спиртовыми растворами натрия гидроксида, алюминия хлорида и диазореактива [2–4].

Для установления природы флавоноидных гликозидов проводили их кислотный гидролиз. Для этого с хроматограммы вырезали неразделяющиеся пятна темно-коричневой флюоресценции, измельчали, заливали 8% хлороводородной кислотой и нагревали на водяной бане [2–5].

Ход гидролиза контролировали с помощью хроматографии на бумаге в системе растворителей: н-бутанол – уксусная кислота – вода в соотношении 4 : 1 : 2 и системе Форесталя (уксусная кислота – хлороводородная кислота – вода в соотношении 30 : 3 : 10). Для идентификации агликонов флавоноидов, элюированных с хроматограмм до и после гидролиза, использовали характерное свечение их в УФ-свете, величины Rf, а также окраску пятен на хроматограмме после проявления парами аммиака и раствором алюминия хлорида в сравнении с достоверными образцами и данными литературы [2–4].

Углеводы, образующиеся в результате гидролиза флавоноидных гликозидов, анализировали методом хроматографии на бумаге в системе растворителей ацетон – н-бутанол – уксусная кислота – вода (7 : 2 : 2 : 2). Детектирование углеводных компонентов проводили бутанольным раствором анилинфталата с последующим прогреванием хроматограмм в сушильном шкафу при t=105 ºС до проявления пятен [2, 5, 6].

Фенолокислоты исследовали методом хроматографии на бумаге в 2% уксусной кислоте восходящим способом. Детектирование кислот проводили в УФ-свете при длине волны 365 нм [5, 7].

Доказательство наличия арбутина в исследуемом сырье проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента. Для этого 5 мл водного экстракта помещали в фарфоровую чашку и упаривали досуха на водяной бане. Остаток в чашке растворяли в 1 мл 96% этанола. На линию старта пластинки «Kieselgel 60 F254» наносили микропипеткой в одну точку 0,1 мл исследуемого экстракта, во вторую точку – 4 мкл раствора А достоверного образца арбутина. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5 мин, помещали в камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью растворителей хлороформ – этанол (6 : 4) и хроматографировали восходящим способом до прохождения фронта растворителя около 13 см. Пластинку вынимали из камеры, сушили под тягой в течение 5 мин и обрабатывали раствором 10% спиртового раствора гидроксида натрия, а затем реактивом Паули (раствор диазотированной сульфаниловой кислоты). Арбутин отделяется от сопутствующих веществ и проявляется в виде красно-оранжевого пятна на уровне достоверного образца. При этом на хроматограмме проявляются пятна других фенольных соединений [8, 9].

Кроме ТСХ для идентификации арбутина и гидрохинона в исследуемых объектах использовали метод Х. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Миллихром-А-02» с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы МультиХром СПЕКТР для Windows. В качестве неподвижной фазы использовали колонку ProntoSIL 120-5-C18 AQ, №80303 размером 2,0×75 мм, размер частиц – 5,0 мкм; в качестве подвижной фазы – [4M LiClO4+0,1M HClO4] : H2O в соотношении 5 : 95. Скорость подачи элюента – 100,00 мкл/мин. Температура – 40 °C. Давление – 2,0 MPa. Продолжительность анализа – 115 мин. Параллельно с испытуемым раствором вводили в хроматограф растворы достоверных образцов арбутина, гидрохинона и рутина. Детектирование данных веществ проводили по УФ-спектрам при длинах волн 210–300 нм [8, 10].

Обсуждение результатов

Результаты хроматографического анализа спиртовых экстрактов голубики, черники, толокнянки, брусники и зимолюбки, представленные на рисунках 1–7 и в таблицах 1, 2, показывают, что при детектировании в УФ-свете и качественными реакциями со спиртовыми растворами натрия гидроксида, алюминия хлорида и диазореактива на хроматограммах было обнаружено не менее 12–21 веществ фенольной природы. При этом вещества, имеющие желтую флюоресценцию, можно отнести к агликонам флавоноидов. Другие пятна давали темно-коричневую окраску в УФ-свете, что характерно в основном для гликозидов производных флавона и флавонола. Остальные вещества на хроматограммах проявлялись в виде голубых, синих и сине-фиолетовых пятен. Такое свечение характерно для кумаринов, оксикоричных кислот, а также некоторых флавоноидов (изофлавонов) [2–4]. При этом хроматограммы отличались как по количеству пятен, так и их хроматографическому поведению (окраске пятен до и после проявления в УФ-свете, значениям Rf. Однако отмечено, что во всех исследуемых экстрактах, в том числе экстрактах толокнянки и брусники, присутствуют характерные фенольные соединения, которые по окраске пятен можно отнести к агликонам и гидроксикоричным кислотам.

После обработки хроматограмм парами аммиака и 2% спиртовым раствором алюминия хлорида пятна агликонов приобрели ярко-желтую флуоресценцию, темно-коричневые пятна приобрели желто-зеленую окраску, что характерно для флавоновых гликозидов. Для установления их природы проводили кислотный гидролиз.

По характерному свечению в УФ-свете, величине Rf, а также окраске пятен на хроматограмме после проявления парами аммиака и раствором алюминия хлорида в сравнении с достоверными образцами и данными литературы агликоны флавоноидов идентифицированы как кверцетин, лютеолин, кемпферол, мирицетин, дигидрокверцетин.

Углеводы, образующиеся в результате гидролиза флавоноидных гликозидов, идентифицированы как глюкоза, рамноза и арабиноза. Таким образом, на основании полученных результатов предположили, что флавоноидные гликозиды в исследуемых растениях представлены рутином, кверцетином, авикулярином и глюкозидом кверцетина.

Полученные результаты анализировали и сопоставляли с данными литературы по составу флавоноидов исследуемых объектов. Установлено, что толокнянка, брусника, черника и зимолюбка, произрастающие в Якутии, по составу флавоноидов идентичны европейским видам. В листьях голубики впервые обнаружены кемпферол, мирицетин, кверцетин, глюкозид кверцетина, дигидрокверцетин, лютеолин.
Флавоноиды, идентифицированные в исследуемых объектах.

Схема хроматограммы экстракта толокнянки:
1-е направление – 15% уксусная кислота; 2-е направление – БУВР

Схема хроматограммы экстракта зимолюбки:
1-е направление – 15% уксусная кислота; 2-е направление –БУВ

Схема хроматограммы экстракта черники:
1-е направление – 15% уксусная кислота; 2-е направление – БУВ

Схема хроматограммы экстракта голубики:
1-е направление – 15% уксусная кислота;
2-е направление – БУВ

Схема хроматограммы экстракта брусники.
1-е направление – 15% уксусная кислота;
2-е направление – БУВ

Схема хроматограммы этанольных извлечений: растворитель – 2% уксусная кислота.
Б – брусника; Г – голубика; З – зимолюбка; Т – толокнянка; Ч – черника

Схема хроматограммы водных экстрактов: система растворителей: хлорофом – этанол (6 : 4).
Проявитель:

реактив Паули 1 – толокнянка; 2 – брусника; 3 – черника; 4 – голубика; 5 – зимолюбка; 6 – арбутин

При детектировании фенолокислот в УФ-свете при длине волны 365 нм отмечено несколько зон адсорбции с голубой, голубовато-зеленой и голубовато-фиолетовой флюоресценцией, которые после проявления хроматограммы реактивом Паули (диазотированная сульфаниловая кислота в щелочной среде) приобретали различную окраску в видимом свете (рис. 6). По хроматографическому поведению (окраске пятен в УФ-свете, окраске в видимом свете после проявления реактивом Паули, значениям Rf при сравнении с заведомо известными веществами) нами идентифицированы кофейная, п-кумаровая, синаповая, феруловая и хлорогеновая кислоты.

Хроматографическая характеристика флавоноидов толокнянки, брусники, голубики, черники и зимолюбки

Значение Rf Вещества Окраска пятен в УФ БУВ
4 : 1 : 2 15% уксусная кислота

Система Форесталя Объекты исследования
Кемпферол желто-зеленая 0,90 0,09 0,55 Толокнянка, брусника, черника, голубика, зимолюбка
Лютеолин темно-желтая 0,85 – 0,80 Толокнянка, брусника, черника, голубика, зимолюбка
Мирицетин золотисто-желтая 0,43 – 0,28 Толокнянка, голубика, зимолюбка
Кверцетин желтая 0,78 – 0,41 Толокнянка, голубика
Глюкозид кверцетина желтая 0,32 0,10 – Толокнянка, голубика
Дигидрокверцетин слабо-пурпурная 0,78 0,13 – Толокнянка, голубика, зимолюбка
Кверцитрин темно-желтая 0,72 0,49 – Толокнянка, брусника, черника
Изокверцитрин темно-коричневая 0,58 0,37 – Толокнянка, черника
Авикулярин – 0,70 0,31 – Брусника, зимолюбка
Рутин темно-коричневая 0,45 0,51 – Черника

Исследуемые объекты отличаются по составу фенолокислот. Так, галловая и протокатеховая кислоты обнаружены нами только в листьях толокнянки; изохлорогеновая кислота – в листьях брусники. Наиболее характерны для анализируемых объектов кофейная и хлорогеновая кислоты, которые присутствуют в листьях брусники, черники, голубики и зимолюбки. В листьях голубики данные кислоты обнаружены нами впервые.

Хроматографический анализ водных экстрактов исследуемых образцов сырья подтвердил не только достоверное присутствие арбутина во всех исследуемых видах, но также по интенсивности окраски пятен позволил судить о содержании арбутина и расположить растения в следующей последовательности: наибольшее содержание арбутина следует ожидать в листьях зимолюбки, затем – толокнянки, брусники, черники, и небольшое количество – в листьях голубики.

Наличие в молекуле арбутина остатка гидрохинона с достаточной сопряженной системой предполагает поглощение света определенной длины волны с максимумом поглощения при λ=220 нм в УФ-области, поэтому для идентификации арбутина использовали спектры экстрактов исследуемых растений (рис. 8). Анализ УФ-спектров показывает, что на них присутствуют 2 максимума поглощения, характерных для арбутина – 220 и 284 нм [8, 9], причем интенсивность (выраженность) пиков соответствует содержанию арбутина в исследуемых видах: наибольшая интенсивность пика при 220 нм характерна для толокнянки, брусники и зимолюбки, менее выражены пики в этой области для черники и голубики.

Представлены ВЭЖ-хроматограммы водных экстрактов голубики, зимолюбки и черники, на которых по УФ-спектрам в сравнении с достоверным образцом идентифицирован арбутин.

Хроматографическая характеристика фенолокислот толокнянки, брусники, голубики, черники и зимолюбки
Окраска пятен Фенолокислоты УФ-свет Видимый свет, реактив Паули
Значение Rf Объекты исследования
Кофейная светло-голубая коричневая 0,80 Брусника, черника, голубика, зимолюбка
п-Кумаровая голубо-фиолетовая красно-коричневая 0,74 Брусника, голубика
Синаповая голубо-зеленая голубо-фиолетовая 0,51 Голубика, зимолюбка
Феруловая голубая фиолетовая 0,32 Брусника, голубика
Хлорогеновая голубая желто-коричневая 0,30 Брусника, черника, голубика
Галловая светло-голубая синяя 0,62 Толокнянка
Протокатеховая фиолетовая красно-серая 0,70 Толокнянка
Изохлорогеновая голубая желто-коричневая 0,18 Брусника

УФ-спектры этанольных экстрактов

листьев брусники (1), толокнянки (2), зимолюбки (3), черники (4) и голубики (5)
140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 мкл

ВЭЖХ хроматограмма водного экстракта голубики болотной
ВЭЖХ хроматограмма водного экстракта зимолюбки зонтичной
ВЭЖХ хроматограмма водного экстракта черники обыкновенной

Выводы

Обобщая результаты сравнительного исследования фенольных соединений листьев толокнянки, брусники, голубики, черники и зимолюбки, произрастающих на территории Республики Саха (Якутия), следует отметить, что их качественный состав несколько различен: в их составе идентифицировано 10 флавоноидов и 8 гидроксикоричных кислот. Впервые установлен качественный состав флавоноидов и фенолкарбоновых кислот голубики обыкновенной, произрастающей на территории Якутии. В данном виде преобладают кемпферол, мирицетин, кверцетин, кверцитрин, изокверцитрин, дегидрокверцетин, глюкозид кверцетина.

Гидроксикоричные кислоты представлены кофейной, п-кумаровой, синаповой, феруловой и хлорогеновой кислотами.

Во всех исследуемых видах достоверно присутствуют вещества-маркеры: кемпферол, лютеолин и кофейная кислота, подтверждающие несомненную систематическую близость данных видов. Полученные результаты показывают возможность использования листьев черники, голубики и зимолюбки не только наравне или в дополнение к официнальным арбутинсодержащим видам сырья толокнянки и брусники, но и перспективность данных видов для медицинской практики по другим фармакологическим тестам.

Список литературы

1. Охрименко Л.П., Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е. Сравнительное исследование толокнянки, брусники и близких к ним видов, произрастающих в Республике Саха (Якутия) // Химия растительного сырья, 2005. №1. С. 31–36.
2. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Т. 1. Вып. 4. С. 591–597.
3. Harborne J.B. Comparative biochemistry of the flavonoids. London, New York, 1967. 383 p.
4. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of Flavonoids. New York etc. Springer – Verlag, 1970. 354 p.
5. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 174 с.
6. Методы исследования углеводов / пер. с анг. В.А. Несмеянова; под ред. проф. А.Я. Хорлина. М., 1975. 445 с.
7. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. 1983. Вып. 3. С. 263–272.
8. Китанов Г.М., Генова Е.М., Руменин В.М. Содержание арбутина в Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. из разных районов Народной Республики Болгарии // Растительные ресурсы. 1986. Вып. 3. С. 425–431.
9. Федосеева Л.М. Анализ арбутина подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch., произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья, 2003. №1. С. 73–77.
10. Стыскин, Е.Л., Ициксон Л.Б., Браудэ Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., 1986. 288 с.