ИЗУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ЗЕЛЕНЫХ, КРАСНЫХ И ЧЕРНЫХ ЛИСТЬЕВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА АЛТАЕ Л.М. Федосеева, Т.С. Малолеткина Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул

Целью работы является выделение, изучение и сравнительная оценка липофильной фракции зеленых, красных и черных листьев бадана. Исследования проводились химическими и физико-химическими методами (ФЭК, ТСХ, ВЭЖХ). В результате установлено содержание хлорофилла, каротиноидов, витаминов А и Е, которые составляют сумму липофильных веществ листьев бадана. Зеленые листья содержат большее количество хлорофилла; черные –большее количество липофильной фракции, каротиноидов, витамина Е.

Введение. В настоящее время широко ведутся исследования дикорастущих лекарственных растений. Актуален вопрос фитохимического изучения сырья с целью рационального его использования для лечения различных заболеваний.

Одним из перспективных объектов изучения является бадан толстолистный (Bergenia crassifolia (L) Fitsch.) семейство камнеломковых (Saxifragaceae) – травянистый вечнозеленый многолетник.
На одном растении в течение нескольких вегетационных периодов имеются зеленые, красные и черные листья [1].

Сведения о химическом составе листьев бадана ограничены. Установлено, что это одно из немногих растений, листья которого содержат значительное количество фенольных соединений: арбутин, гидрохинон, дубильные вещества, флавоноиды, кумарины [2].
Не изучен липофильный состав листьев бадана. В состав липофильных веществ растений входят хлорофилл, каротиноиды и жирорастворимые витамины.

Хлорофилл – зеленый пигмент, содержащийся в хлоропластах, является Mg-порфирином, участвует в фотосинтезе. В настоящее время известно около 10 пигментов, входящих в группу хлорофиллов, отличающихся друг от друга некоторыми структурными особенностями. Длинная углеродная цепь – остаток фитола, присоединенный к порфириновой части молекулы хлорофилла, обладает липофильными свойствами, а порфиновое ядро – гидрофильными [3].

Хлорофилл обладает широким спектром действия на живой организм. Возможным механизмом его многообразных эффектов является облегчение процессов переноса зарядов, в том числе биологически активного вещества на соответствующую мишень или рецептор и сопутствующее УФ излучение при рекомбинации свободных радикалов или в других реакциях. Сходство хлорофилла по своей химической структуре с гемоглобином крови обусловило широкое применение в медицине его препаратов как средств, усиливающих процессы кроветворения. Кроме этого, хлорофилл обладает антимикробной активностью,успешно применяется для лечения ран и ожогов,оказывает тонизирующее действие на организм, стимулирует работу сердца, нервно-мышечного аппарата, дыхательного центра и пр. [4, 5]

Каротиноиды – оранжевые и желтые пигменты, находятся в хлоропластах и хромопластах.
Обнаружено свыше 300 видов каротиноидов, некоторые из них играют роль витаминов и участвуют в фотосинтезе. Каротиноиды относятся к тетратерпенам. Их молекулы содержат значительное количество сопряженных двойных связей и поэтому окрашены, для природных каротиноидов характерна транс-конфигурация двойных связей[3].

В растениях обычно присутствуют две группы каротиноидов – каротины и ксантофиллы. Ксантофиллы - соединения, в отличие от каротинов, содержащие кислород. В зеленых листья каротиноиды маскируются большим количеством хлорофилла. Каротины в растениях могут находиться в форме трех изомеров: α, β, γ, но чаще в виде β-каротина. Из каротинов синтезируется витамин А [6]. Витамин А и каротиноиды способствуют нормальному обмену веществ, росту и развитию растущего организма. Витамин А обеспечивает нормальную деятельность органа зрения, оказывает благоприятное влияние на функции слезных и потовых желез, повышает устойчивость организма к инфекциям. Принимает участие в окислительновосстановительных процессах, нормализует потребление кислорода тканями организма.

Токоферолы – витамин Е, являются природными антиоксидантами, защищают различные вещества в организме от окислительных процессов, тем самым препятствуют старению организма. Участвуют в биосинтезе белков, тканевом дыхании и способствуют регенерации тканей. Витамин Е является смесью высокомолекулярных спиртов – α-, β-, γ-, δ-токоферолов. Наиболее активным является β-токоферол, который встречается во многих лекарственных растениях [7].

Целью настоящей работы является фитохимическое исследование липофильного комплекса зеленых, красных и черных листьев бадана и сравнительная оценка его качественного и количественного состава.
Для исследований использовали листья бадана, собранные в Шеболинском районе Республики Алтай в 1996–1998 гг.

Экспериментальная часть. Выделение липофильных веществ из листьев бадана проводили следующим образом: сырье, измельченное до размера частиц не более 1 мм,заливали n-гексаном. Экстракцию проводили в течение 3 суток. В результате получили извлечение, содержащее сумму липофильных веществ, количественное определение которых проводили гравиметрическим методом [8], оно составило в зеленых листья 2.29±0.01%, в красных –3.23±0.15%, в черных – 3.45±0.11% .
Проводили идентификацию веществ, составляющих липофильную фракцию химическими и физико-химическими методами.

Хлорофилл определяли по способности флюоресцировать в УФ свете. 0.01 г сухого остатка липофильных веществ растворяли в 10 мл 96%-ного этанола и просматривали в УФ свете, наблюдали рубиново-красную флюоресценцию, характерную для хлорофилла в вытяжке из зеленых и красных листьев. Реакция на хлорофилл в вытяжке из черных листьев была отрицательной.

Дальнейшую идентификацию хлорофилла проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе «Милихром-1» в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм, измерения проводили через 2 нм. В результате получили хроматограмму с максимумом поглощения при длине волны 210 нм,которая совпала со стандартным образцом.

Количественное определение хлорофилла в листьях бадана проводили фотоколориметрическим методом [1].

Результаты количественного определения липофильных веществ в зеленых, красных и черных листьях бадана


Липофильные вещества
Содержание в зеленых листьях, %
Содержание в красных листьях, %
Содержание в черных листьях, %
Сумма липофильных веществ 2.29±0.11 3.23±0.15 3.45±0.11
Хлорофилл 1.35±0.11 1.15±0.21 —
Каротиноиды 0.73±0.14 0.85±0.10 1.48±0.18
Витамин А 0.02±0.008 0.05±0.002 0.04±0.007
Витамин Е 0.13±0.01 0.25±0.01 0.54±0.03

Оптическую плотность определяли на ФЭК-56М с красным светофильтром. Измеряли интенсивность окраски зеленого пигмента при извлечении его этиловым спиртом. В результате проведенных исследований установлено, что зеленые листья бадана содержат 1.35% хлорофилла, в красных – 1.15% (табл. 1).
Жирорастворимые витамины А и Е, каротиноиды идентифицировали по реакциям окрашивания. Проводили параллельные опыты с растворами исследуемых веществ и стандартных растворов.
Витамин Е определяли по реакции с концентрированной азотной кислотой, наблюдали красное окрашивание. Витамин А и каротиноиды идентифицировали по реакции с хлоридом сурьмы (III), образуется синее окрашивание. Идентифицировать эти два вещества по реакции с хлоридом сурьмы не возможно, так как окраски совпадают.
Для дальнейшего определения витамина А и каротиноидов проводили тонкослойную хроматографию (ТСХ).
ТСХ проводили на пластинках «Силуфол» в двух системах: бензол–этилацетат–метанол (100:6:0.5) – система 1 и циклогексан–этиловый эфир (80:20) – система 2 [10]. В качестве растворов-стандартов использовали n-гексановые растворы витамина А, витамина Е и масла облепихового. После хроматографирования пластинки высушивали и обрабатывали 10%-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле, высушивали при температуре 60–80°С, появлялись пятна синего цвета на желтом фоне.

В результате при хроматографировании исследуемых извлечений листьев бадана и раствора масла облепихового в системе 1 наблюдалось 3 пятна с Rf: 0.21; 0.35; 0.94 стандартных растворов
витамина А и Е – по одному пятну с Rf 0.94, в системе 2 в исследуемом растворе и в растворе масла облепихового наблюдали два пятна с Rf 0.15 и 0.36 .

Результаты ТСХ липофильных веществ листьев бадана в системе бензол-этилацетат-метонол (100:6:0.5)
Rf первого пятна Rf второго пятна Rf третьего пятна
Извлечения зеленых листьев 0.21 0.35 0.94
Извлечения красных листьев 0.21 0.35 0.94
Извлечения черных листьев 0.21 0.35 0.94
Масло облепихи 0.21 0.35 0.94
Витамин Е-стандарт — — 0.94
Витамин А-стандарт — — 0.94

Результаты ТСХ липофильных веществ листьев бадана в системе циклогексан-этиловый эфир (80:20)
Rf первого пятна Rf второго пятна
Извлечения зеленых листьев 0.36 0.15
Извлечения красных листьев 0.36 0.15
Извлечения черных листьев 0.36 0.15
Масло облепиховое 0.36 0.15
Витамин А-стандарт 0.36 —
Витамин Е-стандарт 0.36 —

По данным ТСХ идентифицировать витамины А и Е, каротиноиды не представляется возможным, значение Rf совпали, поэтому провели ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-1», микроколонку заполняли сорбетном «Нуклеосил С-18».
Исследуемые вещества, каротиноиды, витамины А и Е растворяли в н-пропаноле.
Определение витамина А проводили при длине волны 330 нм, каротиноидов – 360 нм, витамина Е – 290 нм. В результате определения липофильных веществ, получили их пики, представленные на хроматограммах, по которым можно определить качественный и количественный состав исследуемых веществ.
Качественное определение липофильных веществ листьев бадана проводили по времени удержания, оно устанавливается по времени от момента ввода пробы до появления максимума пика на хроматограмме. В результате качественного анализа исследуемой суммы липофильных веществ и стандартных образцов время удержания совпало и составило: витамина А – 1.31 мин, витамина Е – 1.83 мин, каротиноидов – 2.55 мин. В связи с чем делаем заключение о присутствии в липофильной фракции зеленых, красных и черных листьев бадана витаминов А и Е, каротиноидов.
Количественное определение суммы липофильных веществ листьев бадана методом ВЭЖХ проводили по абсолютной калибровке, сущность метода заключается в том, что строят калибровочный график по стандартному раствору, используя значения высот пиков и концентраций определенного вещества. По калибровочным графикам проводят расчет содержания липофильных веществ. В зеленых листьях бадана количественное содержание витамина А – 0.02%, витамина Е – 0.13%, каротиноидов – 0.73%; в красных листьях витамина
А – 0.05%, витамина Е – 0.25%, каротиноидов –0.85%; в черных листьях витамина А – 0.04%, витамина Е – 0.54%, каротиноидов – 1.48%

Выводы

Выделена сумма липофильных веществ, она составила в зеленых листьях бадана 2.29%, в красных – 3.23%, в черных – 3.45%.
Проведена идентификация веществ липофильной природы химическими реакциями, хроматографическими методами (ТСХ, ВЭЖХ), установлен качественный состав: хлорофилл, каротиноиды, витамины А и Е.
Определено количественное содержание веществ липофильной фракции фотоэлектроколориметрическим методом и ВЭЖХ. В зеленых листьях хлорофилла 1.35%, каротиноидов – 0.73%, витамина А – 0.02%, витамина Е – 0.13%; в красных – хлорофилла 1.15%, каротиноидов – 0.85%, витамина А – 0.05%, витамина Е – 0.25%; в черных –хлорофилла не обнаружено, каротиноидов – 1.48%, витамина А – 0.04%, витамина Е – 0.54%.
Установлено, что черные листья бадана содержат большее количество липофильных веществ –3.45%, каротиноидов – 1.48%, витамина Е –0.54%. Зеленые листья содержат большее количество хлорофилла – 1.35%.

Список литературы

1. Гаммерман А.Ф., Монтеверде Н.Н., Соколов В.В. Лекарственные растения России // Растительные ресурсы России. М.-Л., 1957. Т. 2: Натуральные растения. 450 с.
2. Федосеева Л.М., Коваленко С.А., Дитрих О.В. Биологически активные вещества бадана толстолистного, произрастающего на Алтае // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений. Томск, 1996. С. 178–180.
3. Тюкавкина Н.А., Буков Ю.И. Биофармацевтическая химия. М., 1991. С. 477.
4. Кадымова К.Г. Хлорофилл в лечении ран // Сб. науч. работ НИИ рентгенологии, радиологии, онкологии. Баку, 1953. С. 223–230.
5. Курнигин В.Т., Никитина Т.В. Антибактериальное действие препаратов хлорофилла // Тез. докл. 8-го совещ. по проблемам фитонцидов. Киев, 1979. С. 55.
6. Максютина Н.П., Комиссаренко Н.Ф., Прокопенко А.П. Растительные лекарственные средства. Киев, 1983. 104 с.
7. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. М., 1991. 560 с.
8. Ветров П.П., Гарная С.В., Долгоненко Л.Г. Определение содержания липофильных веществ и суммы каротиноидов в растительном сырье // Химико-фармацевтический журнал. 1989. №3. С. 320–325.
9. Баранов Р.А. Получение и анализ хлорофилла из хвои сосны и ели // Тез науч. Докл. Витаминные растительные ресурсы и их использование. М., 1985. С. 339–344.
10. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.