АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ CALENDULA OFFICINALIS L. П.Б. Лубсандоржиева Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул Сахьяновой, 6, Улан-Удэ (Россия)

Определены содержание биологически активных веществ и антиоксидантная активность экстрактов из цветков Calendula officinalis L. Экстракт из указанного сырья, содержащий липофильные и среднеполярные вещества, характеризуется большей антиоксидантной активностью, чем водный и 50% этанольный экстракты.

Введение


Многостороннее фармакологическое действие препаратов Calendula officinalis L. связано с содержанием в цветках различных классов вторичных метаболитов: каротиноидов, стеринов, моно-, сескви- и тритерпеноидов, фенольных соединений, полисахаридов [1, 2]. С. officinalis – доминирующий компонент антиязвенного средства «Вентрофит» и его исходного сбора [3].

Цель данной работы


определить вклад биологически активных веществ (БАВ) C. officinalis различной полярности в антиоксидантную активность (АОА) экстрактов.

Экспериментальная часть


Из аптечных образцов сырья – цветков С. officinalis получены экстракты сухие: экстракт №1, содержащий липофильные вещества (экстрагент – 80 и 50% этанол) [3]; экстракт №2, содержащий гидрофильные вещества (экстрагент – вода очищенная); экстракт №3, содержащий среднеполярные вещества (экстрагент –50% этанол). Для изучения качественного состава экстракта С. officinalis использована тонкослойная хроматография на силикагеле (ТСХ) с подвижной фазой: этилацетат – муравьиная кислота – уксусная кислота –вода 100 : 11 : 11 : 26 (I); хлороформ – уксусная кислота – этанол – вода 60 : 32 : 14 : 6 (II); бензол – этилацетат (III). Для обнаружения флавоноидов брали 2% спиртовый раствор алюминия хлористого, пары аммиака;
тритерпеновых сапонинов – 1% раствор ванилина в концентрированной серной кислоте, 20% раствор фосфорновольфрамовой кислоты. Количественное определение биологически активных веществ проведено по известным методикам [3]. АОА растительных объектов обнаруживали по методу, основанному на способности биологической жидкости тормозить накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в суспензии желточных липопротеидов, взятой в качестве модельной системы окисления [4]. Величину АОА экстрактов и отваров оценивали по концентрации испытуемого раствора в (г/л)–1, необходимой для ингибирования образования продукта (ПОЛ) – малонового диальдегида (МДА) на 50%.

Обсуждение результатов


На хроматограмме экстракта №1 доминирующими флавоноидами, реагирующими с алюминия хлоридом, являются вещества с Rf (I): 0,35–0,45 (нарциссин [5]); 0,28–0,40; 0,58–0,60; 0,1–0,2; 0,08–0,15. Наибольшее количество флавоноидов обнаружено в экстракте №1, среднеполярные флавоноиды в экстракте №3 содержатся в меньшем количестве, чем в экстракте №2. Таким образом, большая часть флавоноидов C.officinalis имеет гидрофобную природу и извлекается спиртом высокой концентрации. Тритерпеновые сапонины, реагирующие с 1% раствором ванилина в концентрированной серной кислоте и 20% раствором фосфорновольфрамовой кислоты, имеют Rf (II): 0,22; 0,43; 0,65 и Rf в системе (III): 0,05; 0,22; 0,33; 0,68; 0,80.
Известно, что в C. officinalis L. содержатся свободные и связанные тритерпеновые спирты – 5%, олеаноловая кислота и ее гликозиды (календулозиды A, B, C, D, E, F, G, H) – 4–5% [1]. Тритерпеновые сапонины извлекаются спиртом разной концентрации равномерно, и различия в их количественном содержании в экстрактах незначительны. Основное фармакологическое свойство C. officinalis – противовоспалительное, оно обусловлено наличием тритерпеновых спиртов, сапонинов, тритерпеновых эфиров жирных кислот [6].
Олеаноловая кислота и ее производные не обладают антирадикальной активностью, но в разной степени ингибируют NO-продукцию в липополисахарид-активированных макрофагах [7].

Экстракты С. officinalis не отличаются высокими значениями АОА, что согласуется с литературными данными [7, 8]. Антирадикальная активность водного и метанольного экстракта C. officinalis в опыте с пероксильными радикалами была ниже, чем в опыте с гидроксильными радикалами, но выше, чем в опыте с DPPH-радикалами [2]. Авторы [2] предположили, что на подобные различия влияют следующие обстоятельства: кинетические константы реакции между гидроксильным радикалом и фенольными соединениями (ФС)
выше, чем для реакции между пероксильными радикалами или радикалами DPPH и ФС; синергическое действие веществ с разной полярностью. В другом опыте водные и спиртовые извлечения из C. officinalis с разным
содержанием фенольных антиоксидантов показали почти идентичную АОА [7]. Экстракт из C. officinalis, содержащий 3,4 мг/г флавоноидов и 6,6 мг/г ФС, проявлял незначительную антирадикальную активность [8].

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее эффективен в ингибировании образования МДА полиэкстракт, содержащий липофильные и среднеполярные вещества (экстракт №1). Среднеполярные вещества С. officinalis, экстрагируемые 50% этанолом, наименее эффективны, но в комбинации с липофильными веществами (экстракт №1) показывают более высокую АОА. Водорастворимые вещества С. officinalis обладают большей АОА в диапазоне низких доз (0,05–0,40 мг/мл), чем среднеполярные вещества, экстрагируемые 50% этанолом. В водном экстракте присутствуют антиоксиданты (АО) – гликозиды флавоноидов [9], полифенолы, хлорогеновая, кофейная, р-кумаровая и ванилиновая кислоты [2] в комбинации с полисахаридами [1, 10], восстанавливающими фенольные АО до исходных концентраций.
Известно, что для АОА и радикалперехватывающей активности флавоноидов важны следующие структурные особенности: О-дифенольная группа в кольце В; 2–3-двойная связь, конъюгированная с 4-оксо функцией, и гидроксильные группы в положении 3 и 5 кольца С. Флавоноиды С. officinalis представлены производными флавона, флавонола с тремя (нарциссин – доминирующий флавоноид [5], календофлазид I, календофлавозид II), четырьмя (изорамнетин, календофлавобиозид III, изорамнетин-3-О-β-D-глюкопиранозид, изокверцитрин) и пятью (кверцетин) гидроксильными группами [9]. По своим структурным особенностям дигликозиды и монозиды флавоноидов С. officinalis, извлекаемые в водный экстракт, не могут считаться сильными АО: замещение 3-ОН группы в кольце С на углеводную часть, присутствие одиночной ОН-группы в кольце В даже в комбинации с сопряженной двойной связью снижают АОА [11, 12]. ОН-группы кольца А флавоноидов также имеют низкую реактивность по отношению к пероксильным радикалам [12].
Другие водорастворимые АО C. officinalis – фенолокислоты в тест-системах in vitro обладают достаточно высокой АОА, убывающей в ряду: хлорогеновая > кофейная > феруловая > кумаровая кислоты [13]. В липофильной фазе с пероксильными радикалами дифенолы (хлорогеновая и кофейная) были более эффективны, чем монофенолы (протокатеховая и р-кумаровая кислоты). Присутствие —СН═СН—СООН группы в коричной кислоте обеспечивает большую Н-донорскую способность и стабилизацию образованного радикала, чем присутствие карбоксилатной группы в бензойных кислотах. Так, кофейная, синаповая, феруловая и п-кумаровая кислоты более активны, чем протокатеховая, сиринговая, ванилиновая кислоты в липидной системе [11].

Содержание биологически активных веществ в сырье и экстрактах С. officinalis


Наименование Содержание биологически активных веществ
Сырье Экстракт 1 Экстракт 2 Экстракт 3
Флавоноиды, в пересчете на рутин, % 2,35± 0,01 6,48 ± 0,02 2,74 ± 0,01 1,31 ± 0,01
Дубильные вещества, в пересчете на таннин, % 3,28± 0,01 7,09± 0,03 2,45 ± 0,01 1,74 ± 0,01
Каротиноиды, в пересчете на β-каротин, мг % 2,32± 0,01 5,49± 0,01 - 0,32 ± 0,01
Аскорбиновая кислота, % 1,42± 0,01 8,3 ± 0,03 6,41 ± 0,03 7,05 ± 0,02
Тритерпеновые сапонины, в пересчете на олеаноловую кислоту, % 4,13± 0,01 6,08± 0,01 7,92 ± 0,01 8,37 ± 0,06
Водорастворимые полисахариды, % 12,85± 0,10 11,90± 0,10 20,17± 0,14 15,86 ± 0,12

Антиоксидантная активность экстрактов С. officinalis


Концентрация экстрактов, мг/мл
Наименование АОА, (г/л) 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 1,0 2,0 -1
Ингибирование образования МДА, %
Экстракт №1 5,0 15 36 50 62 72 84 86
Экстракт №2 3,8 20 30 44 61 72 81 85
Экстракт №3 2,8 10 19 32 52 73 78 80
Примечание: МДА – малоновый диальдегид

Агликоны флавоноидов – липофильные АО более эффективны, чем их гликозиды и фенолокислоты в тест-системах in vitro [14]. В молекуле кверцетина 3-ОН группа закрепляет положение кольца В в одной плоскости с кольцом А и С через водородную связь, и эта копланарность увеличивает стабильность в флавоноидном феноксильном радикале [12, 13]. Таким образом, высокая АОА кверцетина, содержащегося в С. officinalis в количестве 0,011–0,046% [15], реализуется благодаря присутствию данной межмолекулярной водородной связи и 3',4'-катехола [14, 16].
Протективное действие флавоноидов при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) связано не только с прямой АОА, но и с их способностью уменьшать дезаминирование ДНК, образование токсичного нитрозоамина и особенно хелатировать ионы переходных металлов. Неабсорбированное пищевое железо может вызывать прооксидантное действие в ЖКТ, и присутствие большого количества флавоноидов и других полифенолов С. officinalis способно уменьшить его негативное влияние [11].
Присутствие ионов железа также влияет на активность другого липофильного АО – β-каротина, оказывающего прооксидантный эффект в высоких концентрациях, который может увеличиваться с уменьшением его окислительного потенциала [17]. Кроме β-каротина, в С. officinalis содержатся α- и γ-каротины, зеаксантин, ликопин, лютеин, рубиксантин, цитроксантин, виолаксантин, флавоксантин, хризантемаксантин [1].
Ликопин в настоящее время признан наиболее эффективным АО во многих тест-системах [18], а в смеси с лютеином показывал наилучший протективный эффект. АОА смесей каротиноидов более эффективна, чем индивидуальных соединений, и их синергический эффект может быть обусловлен специфичным положени ем различных каротиноидов в мембранах [19]. Гидрофобность каротиноидов способствует их встраиванию в мембранные фосфолипидно-белковые структуры и дальнейшему быстрому расходованию при индукции перекисного окисления. Так, удаление липофильных веществ (экстракция гексаном) из суммарного экстракта C. officinalis снижало АОА последнего с 5,0 до 3,1 (г/л) –1, и это влияние было значительным при низких дозах экстракта [20]. В данном опыте экстракт №3 с минимальным содержанием каротиноидов в диапазоне доз 0,05–0,2 мг/мл ингибировал образование МДА на 5–18 % меньше, чем экстракт №1 с высоким содержанием каротиноидов.

Выводы


Таким образом, извлекаемые растворителями разной полярности БАВ C. officinalis характеризуются средними значениями АОА in vitro. Синергическое действие БАВ в экстракте №1 обусловлено оптимальной комбинацией эффективных АО – каротиноидов и среднеполярных фенольных соединений.

Список литературы


1. Коновалова О.В., Рыбалко К.С. Биологически активные вещества Calendula officinalis L. // Растительные ресурсы. 1990. Т. 26. Вып. 3. С. 448–463.
2. Ćetković G.S., Djilas S.M., Čanadanović-Brunet J.M., Tumbas V.T. Antioxidant properties of marigold extracts //Food Research International. 2004. V. 37. P. 643–650.
3. Лубсандоржиева П.Б., Ажунова Т.А., Шантанова Л.Н., Унагаева А.А., Муханова Л.Х. Биологически активные вещества антиязвенного растительного средства Вентрофит // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 59–64.
4. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкина Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. 1988. №5. С. 59–62.
5. Шарова О.В., Куркин В.А. Флавоноиды цветков календулы лекарственной // Химия растительного сырья. 2007. №1. С. 65–68.
6. Hamburger M., Adler S., Baumann D., Fërg A., Weinreich B. Preparative purification of the major anti-inflammatory triterpenoid esters from Marigold (Calendula officinalis) // Fitoterapia. 2003. V. 74. P. 328–338.
7. Yang Z.-G., Li H.-R., Wang L.-Y., Li Y.-H., Lu S.-G., Wen X.-F., Wang J., Daikonya A., Kutanaka S. Triterpenoids from Hippophae rhamnoides L. and their nitric oxide production-inhibitory and DPPH radical-scavenging activities //Chem. Pharm. Bull. 2007. V. 55. №1. P. 15–18.
8. Miliauskas G., Venskutonis P.R., Beek T.A. van Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts // Food Chemistry. 2004. V. 85. P. 231–237.
9. Комиссаренко Н.Ф., Чернобай В.Т., Деркач А.И. Флавоноиды соцветий Calendula officinalis // Химия природных соединений. 1988. №6. С. 795–800.
10. Чушенко В.Н., Жуков Г.А., Карамова О.Е., Оболенцева Г.В., Дзюба Н.П. Углеводы соцветий Calendula officinalis // Химия природных соединений. 1988. №4. С. 585–586.
11. Rice-Evans C., Miller N.J., Paganga G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids //Free Rad. Biol. Med. 1996. V. 20. №7. P. 933–956.
12. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radical Biology and Medicine. 1998. V. 24. №9. P. 1355–1363.
13. Soobrattee M.A., Neergheen V.S., Luximon-Ramma A., Aruoma O.I., Baborun T. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions // Mutation Research. 2005. V. 579. P. 200–213.
14. Lopez M., Martinez F., Del Valle C., Ferrit M., Lugue R. Study of phenolic compounds as natural antioxidants by a fluorescence method // Talanta. 2003. V. 60. P. 609–616.
15. Ивасенко С.А., Прибыткова Л.Н., Адекенов С.М., Ющенко Н.С., Бондарец В.Г. Содержание каротиноидов и флавоноидов в соцветиях некоторых сортов Calendula officinalis L. // Растительные ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 2. С. 107–110.
16. Foti M., Piattelli M., Baratta M.T., Ruberto G. Flavonoids, coumarins, and cinnamic acids as antioxidants in a micellar system. Structure – activity relationship // J. Agric. Food Chem. 1996. V. 44. P. 497–501.
17. Polyakov N.E., Leshina V., Konovalova A., Kispert L.D. Carotenoids as scavengers of free radicals in Fenton reaction: antioxidants or pro-oxidants? // Free Radic. Biol. Med. 2001. V. 31. №3. P. 398–404.
18. Rao A.V., Rao L.G. Carotenoids and human health // Pharmacological Research. 2007. V. 55. P. 207–216.
19. Stahl W. Junghans A., Boer B., Driomina E.S., Brivida K., Sies H. Carotenoid mixtures protect multilamellar liposomes against oxidative damage: synergistic effects of lycopene and lutein // FEBS Letters. 1998. V. 427. №2. P. 305–308.
20. Лубсандоржиева П.Б., Ажунова Т.А., Шантанова Л.Н., Николаев С.М., Чукаев С.А., Унагаева А.А., Муханова Л.Х. Вклад каротиноидов в суммарную антиоксидантную активность антиязвенного экстракта in vitro // Сибирский медицинский журнал. 2005. №8. С. 54–57.