ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СОКА КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ (CALLISIA FRAGRANS WOOD.) И ЕГО АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ(IN VITRO) Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, А.А. Торопова, Т.А. Ибрагимов Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ (Россия) ГОУ ВПО «Пятигорская государственная химико-фармацевтическая академия», пр. Калинина, 11, Пятигорск (Россия)

В ходе изучения химического состава сока каллизии душистой (Callisia fragrans Wood., «золотой ус», сем.Commelinаceae), установлено наличие в нем углеводов (полисахаридов и свободной глюкозы), аскорбиновой кислоты, аминокислот, фенолокислот (галловая, кофейная, цикориевая, феруловая), флавоноидов (кверцетин, кемпферол), кумаринов (умбеллиферон, скополетин), антрахинонов (алоэ-эмодин), тритерпеновых соединений (β-ситостерин) и холина. С применением ДФПГ-метода выявлена антирадикальная активность, обусловленная присутствием кумаринов, фенолокислот и аскорбиновой кислоты, а также обнаружена способность сока C. fragrans к связыванию ионов Fe2+, молекул NO, радикалов О2 и инактивации Н2О2.

Введение


Каллизия душистая (Callisia fragrans Wood., «золотой ус», cем. коммелиновые – Commelinaceae) – культивируемое многолетнее суккулентное травянистое растение. Местообитание C. fragrans на родине – влажные леса юга Мексики, полуострова Юкатан и Гватемалы; чаще всего она встречается во вторичном лесу, на месте старых вырубок. В России C. fragrans выращивается как декоративное растение в домашних условиях; она хорошо культивируется в условиях теплицы [1].

Сведения о применении C. fragrans чрезвычайно обширны; с применением системы Google® на запрос по ключевому слову «золотой ус» предлагается более 400 тысяч ссылок. Средства массовой информации (печатные и электронные) рекомендуют данное растение для терапии практически всех известных заболеваний.

Результатов целенаправленных фармакологических исследований C. fragrans и ее препаратов в доступной научной литературе нам обнаружить не удалось.

Данные о химическом составе C. fragrans также немногочисленны. Ранее был изучен состав нейтральных, глико- и фосфолипидов листьев, побегов и стеблей, доминирующими компонентами которых являются пальмитиновая, линолевая, олеиновая и линоленовая кислоты; также установлено присутствие каротиноидов (α-, β-каротины, неоксантин, антераксантин), хлорофиллов (a и b), аскорбиновой кислоты и антоцианов[2]. С применением метода ГХ/МС идентифицированы салициловая, ванилиновая и хлорогеновая кислоты, фитол, ванилин, биформен, сквален, лупеол и бетулин [3].
Целью настоящей работы является исследование качественного состава и количественного содержания биологически активных соединений сока C. fragrans, а также определение антиоксидантной активности в экспериментах in vitro.

Экспериментальные условия


Сырье C. fragrans (надземная часть) предоставлено экспериментальным хозяйством СГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, Россия).
Извлечение сока осуществляли в лабораторных условиях вручную: для этого сырье измельчали на блендере, полученную массу отжимали через капрон и далее фильтровали через бумажный фильтр в вакууме. Полученный сок представлял собой прозрачную жидкость желтого цвета со слабым характерным запахом, содержание сухих веществ (СВС) 2,22%, плотность 0,986 г/см3. Выход сока ~80% от массы свежего сырья.
Фракционирование экстрактивных веществ. 21,5 л сока C. fragrans, полученного из 27 кг свежего сырья, концентрировали до объема 3 л и подвергали жидкофазной экстракции последовательно гексаном, хлороформом, этилацетатом и бутанолом. К водному остатку после жидкофазной экстракции приливали 95% спирт этиловый (1 : 5), выпавший осадок полисахаридов центрифугировали и высушивали сменой растворителей. Супернатант концентрировали до полного удаления спирта этилового и высушивали в вакуум-сушильном шкафу.

Для деминерализации и удаления полисахаридов 100 мл сока C. fragrans пропускали через колонку с катионитом КУ-2-8 (Н+-форма, 1 × 20 см), элюировали 300 мл воды и концентрировали элюат до объема 50 мл. После чего к водному остатку приливали 95% спирт этиловый (1 : 5), выпавший осадок центрифугировали; супернатант концентрировали, высушивали и использовали в эксперименте (сок II).
В работе использовали следующие образцы СОВС: скополетин, умбеллиферон, алоэ-эмодин, аскорбиновая кислота, галловая, кофейная, цикориевая, феруловая кислоты, кверцетин, кемпферол, глюкоза (Fluka), β-каротин (Acros Organics), β-ситостерин, холин, таннин скумпии (Aldrich), а также дифенилпикрилгидразил (ДФПГ, MP Biomedicals Inc.), о-фенантролин, ионол (Fluka); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр UV-Vis-mini (Shimadzu); для регистрации оптической плотности в кинетическом режиме – спектрофотометр Cecil-2001.
ВЭТСХ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер) в следующих условиях: антрацены – этилацетат–MeOH–H2O (100 : 13,5 : 10) (Д: 5% КОН, УФ), тритерпеновые соединения – бензолэтилацетат (2 : 1) (Д: 20% H2SO4, УФ), фенолокислоты – этилацетат–толуол–HCOOH–H2O (100 : 5 : 10 : 10)(Д: NH3, 5% FeCl3, УФ), флавоноиды – этилацетат–HCOOH–CH3COOH–H2O (100 : 11 : 11 : 26) (Д: 5% AlCl3, УФ). Для определения компонентов, обладающих антирадикальной активностью, хроматограммы обрабатывали 0,02% раствором ДФПГ в 95% спирте этиловом.

Для анализа алкалоидов фракции хроматографировали на бумаге FN-16 (Filtrak) клиновидным способом в системе растворителей BuOH–CH3COOH–H2O (4 : 1 : 2), Д: 5% раствор рейнеката аммония в ацетоне.
ВЭТСХ-денситометрический анализ проводили с применением планшетного сканера Mustek 2000 и про граммы для сканирующей денситометрии TLC-Manager 3.1.
ВЭЖХ. Анализ этилацетатной фракции проводили на жидкостном хроматографе Gilston 305 с ручным инжектором Rheodyne 7125; колонка (250×4,6 мм) Kromasil C18 (5 μ); подвижная фаза МеОН–Н2О–Н3РО4 (80 : 120 : 1); Т = 20 ºС; скорость 0,8 мл/мин; УФ-детектор Gilston UV/VIS 151, λ = 254 нм. По 20 мкл исследуемого раствора (0,012% раствор в 70% спирте этиловом) и растворов сравнения (0,05% растворы в 70% спирте этиловом) вводили в хроматограф и хроматографировали.

Количественный анализ сока Каллизия душистая

осуществляли с применением следующих методик: сухой остаток, зольность [4], органические кислоты [5], углеводы [6], фенолы [7], свободные аминокислоты [8], липиды общие – гравиметрическим методом после экстракции смесью CHCl3–MeOH (3 : 1).
Антирадикальную активность определяли с применением ДФПГ-метода по методу Seyoum с соавт. [9], связывание супероксидных радикалов и инактивация пероксида водорода – по методу Chen с соавт. [10], связывание NO – по методу Govindarajan с соавт. [11].
Fe2+-хелатирующая способность. В центрифужную пробирку вместимостью 10 мл вносят 200 мкл исследуемого раствора и 25 мкл 0,003% раствора FeSO4. Раствор термостатируют при 20 °С в течение 10 мин, после чего к нему приливают 3 мл 95% спирта этилового, встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин течение 10 мин. К 3 мл супернатанта приливают 200 мкл 0,005% раствора о-фенантролина в 95% спирте этиловом и определяют оптическую плотность раствора через 10 мин при длине волны 505 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный по аналогичной схеме без введения FeSO4.

Результаты и их обсуждение


В результате фракционирования сока C. fragrans получено 6 фракций. Наибольший выход наблюдается для водной фракции, содержание которой составляет около 50% от массы сухих веществ.
Хроматографический анализ хлороформной фракции показал наличие в ней кумаринов и антраценпроизводных. Содержание кумаринов в хлороформной фракции по данным ВЭТСХ-ДМ составляет 57,31% (концентрация в соке 32 мкг/мл) (рис. 1). В сравнении с хроматографической подвижностью СОВС идентифицированы скополетин и умбеллиферон в соотношении 1,0 : 3,1 (концентрация в соке 6,70 и 20,77 мкг/мл, соответственно), а также алоэ-эмодин в количестве 3,33% от массы фракции (концентрация в соке 1,81 мкг/мл).
В этилацетатной фракции методом ВЭЖХ обнаружено 12 соединений; из них идентифицировано 7

Доминирующим являются галловая и аскорбиновая кислоты (26,03 и 38,12% соответственно), содержание которых в соке C. fragrans составляет 7,62 и 5,21 мкг/мл соответственно.
В ходе исследования общего химического состава сока C. fragrans установлено наличие в нем углеводов (полисахаридов и свободной глюкозы), органических кислот, аминокислот, тритерпеновых соединений и алкалоидов; сердечные гликозиды и иридоиды не обнаружены (табл. 2). На долю углеводов, органических кислот и зольных элементов приходится до 95% от массы СВС; содержание остальных классов соединений не превышает 5%.

Исследованиям активных форм кислорода (АФК) в последнее время уделяется особое внимание по причине их участия в ряде патологических процессов, связанных со свободно-радикальным окислением. К АФК, продуцируемым in vivo, относят супероксидный радикал (О2-), пероксид водорода (Н2О2) и гипохлористую кислоту (HClO). О2 и Н2О2 могут взаимодействовать в присутствии ионов переходных металлов (например Fe2+), в результате чего образуются реакционноспособные гидроксирадикалы. Оксид азота (NO) является плейотропным медиатором некоторых физиологических процессов, но также он участвует в патогенезе воспаления и боли. Поэтому если развитие некоторых патологических процессов связано с дисбалансом между окислительным стрессом и антиоксидантной защитой организма, то существует вероятность ограничения окислительного повреждения введением веществ, способных связывать влияние АФК (О2- и Н2О2), NO и ионов Fe2+.
В экспериментах по определению антирадикальной активности (ДФПГ-метод) установлена величина 50% улавливания ДФПГ-радикалов, составляющая 1,07 мг/мл. После удаления из сока C. fragrans полисахаридов и зольных элементов активность незначительно увеличивается (IC50 = 0,98 мг/мл). Хлороформная фракция проявляет заметную выраженность действия (IC50 = 0,21 мг/мл); после проявления хроматограммы данной фракции раствором ДФПГ-радикала выявлены зоны наиболее активных соединений, идентифицированные со скополетином и умбеллифероном. Наибольшая активность отмечена для этилацетатной фракции (IC50 = 24 мкг/мл), действие которой обусловлено в большей степени присутствием галловой, аскорбиновой и кофейной кислот, что также подтверждено хроматографически (ВЭТСХ-ДФПГ).

При исследовании кинетических кривых связывания ДФПГ растворами сока C. fragrans выявлено дозозависимое действие: при концентрации сока в реакционной смеси 4,5 мг/мл его активность сопоставима с таковой растворов кверцетина в концентрации 0,01 мг/мл (рис. 3).
В экспериментах по определению способности сока C. fragrans связывать Fe2+, О2- и NO, а также инактивировать Н2О2, установлено наличие активности в отношении указанных частиц
При исследовании Fe2+-хелатирующей активности сока C. fragrans найдено, что величина IC50 составляет 0,79 мг/мл (ионол 0,15 мг/мл); для О2- данная величина составляет 0,36 мг/мл.

Сок Callisia fragrans вызывает инактивацию Н2О2:

IC50 составляет 0,57 мг/мл; аналогичные показатели для ионола и таннина составляют 0,46 и 0,75 мг/мл соответственно. Н2О2 является слабым окисляющим агентом, но при взаимодействии с ионами Fe2+ может приводить к образованию гидроксирадикалов, чем обусловлено его токсическое действие. Разрушение Н2О2 наблюдается под влиянием некоторых ферментов (пероксидаза, каталаза), ионов металлов и фенольных соединений, присутствие которых, вероятно, является причиной активности сока C. fragrans.
По отношению к NO сок C. fragrans более активен (IC50 = 2,96 мг/мл), чем таннин (IC50 = 3,50 мг/мл) и несколько уступает по действию аскорбиновой кислоте (IC50 = 1,28 мг/мл).
Проведенные эксперименты показали, что сок C. fragrans проявляет свойства антиоксиданта, нейтрализуя влияние свободных радикалов, NO и ионов Fe2+.

Выводы


В результате проведенных исследований сока каллизии душистой (Callisia fragrans Wood., «золотой ус») установлен его химический состав, представленный разными классами соединений: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, фенольные соединения, тритерпеновые соединения и алкалоиды. В составе фенольных соединений идентифицированы галловая, кофейная, цикориевая, феруловая кислоты, кверцетин, кемпферол, умбеллиферон, скополетин и алоэ-эмодин.

Методами in vitro выявлено наличие антирадикальной активности (ДФПГ-метод), а также установлена способность сока C. fragrans к связыванию ионов Fe2+, молекул NO, радикалов О2- и инактивации молекул Н2О2.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у сока C. fragrans антиоксидантной активности, обусловленной присутствием фенольных соединений и аскорбиновой кислоты.

Список литературы


1. Семенова Л.В., Ямпольский Ю.В. Каллизия – Callisia fragrans (Lindl.) Woodson – выращивание и использование //Лекарственные экзотические растения. Вып. 1. СПб., 2003. 125 с.
2. Черненко Т.В., Ульченко Н.Т., Глушенкова А.И., Реджепов Д. Химическое исследование Callisia fragrans // Химияприродных соединений. 2007. №3. С. 212–213.
3. Кондратьева В.В., Курилов Д.В., Воронкова Т.В., Олехнович Л.С. и др. Callisia fragrans (Lindl.) Woodson как продуцент физиологически активных соединений // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: тез.докл. межд. конф. Сыктывкар, 2007. С. 366–368.
4. Государственная фармакопея. Изд. XI. Вып.2. М., 1990. 398 с.
5. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Маркарян А.А. Методика количественного определения суммарного содержания органических кислот в растительном сырье // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. Вып. 3. С. 112–116.
6. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов // Химия растительного сырья. 2006. №4. С.29–33.
7. Folin O., Ciocalteu V. On tyrosine and triptophane determination in proteins // Journal of Biological Chemistry. 1927. V.LXXIII. P. 627–650.
8. Пахомов В.П., Максимова Т.В., Никулина И.Н., Цыганков В.В., Хромова Л.В. Стандартизация рогов и пантов северного оленя. I. Количественное определение нингидринактивных веществ в порошке рогов северного оленя //Химико-фармацевтический журнал. 1997. №4. С. 53–54.
9. Seyoum A., Asres K., El-Fiky F.K. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids // Phytochemistry. 2006. V. 67.P. 2058–2070.
10. Chen A.-S., Taguchi T., Sakai K., Kikuchi K., Wang M.-W., Miwa I. Antioxidant activities of chitibiose and chititriose //Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2003. V. 26. P. 1326–1330.
11. Govindarajan R., Rastogi S., Vijayakumar M. Studies on the antioxidant activities of Desmodium gagenticum // Biological& Pharmaceutical Bulletin. 2003. V. 26. P. 1424–1427.