МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ОРТИЛИИ ОДНОБОКОЙ (ORTHILIA SECUNDA (L.) HOUSE) С.С. Ломбоева, Л.М. Танхаева, Д.Н. Оленников Иркутская государственная сельскохозяйственная академия,пос. Молодежный, Иркутская обл., Иркутск (Россия) Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН,ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ (Россия)

Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой (Ortilia secunda (L.) House). Относительная ошибка определения не превышает 3%. Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на рутин должно быть не менее 2%.

Введение


Ортилия однобокая – Orthilia secunda (L.) House (Pyrola secunda L. p.p., Ramischia secunda (L.) Garcke) –растение семейства Pyrolaceae Dumort. порядка Ericales, рода Orthilia Rafin. (Ramischia Opiz ex Garcke) [1].

Ортилия однобокая – растение, используемое в народной медицине Сибири, Дальнего Востока, Крыма, Кавказа в виде настоев, отваров, настоек как диуретическое, ранозаживляющее, гемостатическое, противовоспалительное, противоязвенное, вяжущее средство при заболеваниях пищеварительной системы, а также как седатитвное и противоэпилептическое средство [2, 3]. Народы Кавказа использовали надземную часть растения в качестве мочегонного, кровоостанавливающего, ранозаживляющего и вяжущего средства [4]. В Западной Сибири и на Урале ее использовали не только в этом качестве, но и применяли как средство от эпилепсии и диареи [2, 5]. В Восточной Сибири под названиями «боровая матка», «боровинка», «грушовник», «заячья соль», «зимозоль» оно является чрезвычайно популярным средством, применяемым, главным образом, при различных гинекологических заболеваниях: эндометритах, сальпингоофоритах, бесплодии, опухолевых и спаечных процессах, непроходимости маточных труб, эрозии шейки матки и эндоцервитах, при нарушениях менструального цикла, дисфункциональных маточных кровотечениях, гипоплазии матки, аднекситах и кольпитах, а также при заболеваниях органов мочеполовой системы – циститах, уретритах, пиелонефритах и т.д. [5].

Исследованиями, проведенными в Отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН, установлена выраженная противовоспалительная активность сухого экстракта ортилии однобокой [6]. Одним из важнейших аспектов молекулярно-клеточных механизмов противовоспалительного действия извлечений ортилии однобокой является наличие у них высокой антиокислительной и мембраностабилизирующей активностей, реализация которых связана с наличием в них, главным образом, комплекса фенольных соединений и, в большей мере, флавоноидов. Данное обстоятельство позволяет предложить в качестве критерия доброкачественности сырья содержание в нем веществ фенольного характера – флавоноидов.

Цель настоящей работы – разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой.

Экспериментальные условия


Растительным объектом служила надземная часть ортилии однобокой, собранная в 1999–2003 гг. в разных районах респ. Бурятия. В работе использовали ГСО рутина – ФС 42-2508-87, остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Cecil CE 2011.

Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой в пересчете на рутин. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья переносят в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 70% спирта этилового, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл. Экстракцию повторяют дважды в тех же условиях с 50 мл 70% спирта этилового в течение 60 мин при втором контакте фаз и 30 мин при третьем. Объем объединенного извлечения доводят 70% спиртом этиловым до метки (раствор А). 2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 2 мл 2% раствора алюминия хлористого в 95% спирте этиловом, 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки (раствор Б).
Определяют оптическую плотность раствора Б через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Для приготовления раствора сравнения 2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки.
Параллельно определяют оптическую плотность раствора ГСО рутина. Приготовление раствора ГСО рутина. Около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина (ФС 42-2508-87), предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 100–105 оС, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 95% спирте этиловом и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А′). 2 мл раствора А′ переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 2 мл 2% раствора алюминия хлористого в 95% спирте этиловом, 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки. Для приготовления раствора сравнения 2 мл раствора А′ переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки. Метрологическую обработку результатов проводили согласно рекомендациям [7–9]. Инструментальную ошибку спектрофотометра (Кинстр) рассчитывали по бихромату калия [10].

Результаты и их обсуждение


Для определения количественного содержания флавоноидов нами использован метод дифференциальной спектрофотометрии. При исследовании вида дифференциального спектра поглощения спиртового извлечения надземной части ортилии однобокой в присутствии алюминия хлорида установлено, что максимум поглощения находится при длине волны 414 нм. В качестве стандартного вещества выбран рутин, максимум дифференциального спектра поглощения которого также находится при 414 нм (рис. 1). Эта область спектра относительно удалена от максимумов поглощения сопутствующих фенольных и других соединений, содержащихся в извлечении, что позволяет исключить их влияние на результаты анализа.

Для разработки методики количественного определения флавоноидов было изучено влияние на выход флавоноидов различных технологических параметров: типа и концентрации экстрагента, времени и кратности экстракции, температурного режима, соотношения сырья и экстрагента, степени измельчения сырья. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что максимальное извлечение флавоноидов из надземной части ортилии однобокой достигается экстракцией сырья с размерами частиц 1,0–0,5 мм 70% спиртом этиловым при температуре 90–100 ºС в течение 60 мин при первом контакте фаз и соотношении сырье : экстрагент 1 : 100, 60 мин при втором контакте фаз и соотношении 1 : 50, 30 мин при третьем контакте и в соотношении 1 : 50.

В соответствии с господствующей точкой зрения, основной единицей метамерного тела семенного растения является побег, который определяется как стебель с сидящими на нем листьямии другими придатками (почками, шипами, цветоножками и т.д.), образующийся благодаря деятельности одной и той же верхушечной меристемы, не подвергшейся отмиранию. В то же время побег – сложная метамерная система, состоящая сама из более элементарных единиц – приростов (годичных побегов), которые можно определить как участки (части) побегов, отделенные друг от друга зонами замедленного или прекращенного роста (но без отмирания самой меристемы)

Выводы


Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в надземной части ортилии однобокой в пересчете на рутин с учетом оптимальных параметров экстракции: максимальное извлечение флавоноидов из надземной части ортилии однобокой достигается при экстракции сырья с размерами частиц 1,0–0,5 мм 70% спиртом этиловым на кипящей водяной бане в течение 60 мин при первом контакте фаз и соотношении сырье : экстрагент 1 : 100, 60 мин при втором и контакте фаз и соотношении 1 : 50, 30 мин при третьем контакте и соотношении 1 : 50. Относительная ошибка методики не превышает 5%.

Список литературы


1. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств. СПб., 1995. 992 с.
2. Шретер А.И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока. М., 1975. 327 с.
3. Дикорастущие полезные растения Крыма. Ялта, 1971. 278 с.
4. Левчук А.П. Кровоостанавливающие и маточные средства // Труды НХФИ. 1927. Вып. 15. С. 3–79.
5. Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. Иркутск, 1985. 417 с.
6. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Чукаев С.А. Химическое и фармакологическое исследование ортилии однобокой Orthilia secunda (L.) House // Сибирский медицинский журнал. 2003. №1. С. 69–71.
7. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. С. 118–129.
8. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа // Журнал аналитической химии. 1997.Т. 52. С. 1022–1029.
9. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 298 с.
10. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). М., 2001. 380 с.