ИЗУЧЕНИЕ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ПОДЗЕМНЫХ И НАДЗЕМНЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНОВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО (BERGENIA CRASSIFOLIA (L.) FITSCH.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА АЛТАЕ Л.М. Федосеева Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина 40, Барнаул

Целью работы является анализ дубильных веществ корневищ, зеленых, красных и бурых листьев бадана толстолистного. Установлено, что таниды бадана состоят из конденсированных и гидролизуемых дубильных веществ.

Титриметрическим и спектрофотометрическим методами определено количественное содержание суммы конденсированных и гидролизуемых дубильных веществ в исследуемых видах сырья.
Проведена идентификация конденсированных дубильных веществ и установлено, что они состоят из катехина.

Введение. В медицинской практике в качестве лекарственного сырья используют корневища бадана как вяжущее и кровоостанавливающее средство. Листья являются отходами при заготовке сырья. Соотношение в весе листьев и корневищ составляет 1 : 1, что свидетельствует о больших непроизводительных потерях. Представляет интерес возможность комплексного изучения и использования всего растения, а для сохранения вида в природе – применения надземных частей растения наравне или взамен подземных.

Бадан толстолистный (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), семейства камнеломковых (Saxifragaceae) – многолетнее травянистое вечнозеленое растение с мощным ветвистым горизонтальным мясистым, длиной до 2 м корневищем, на котором одновременно присутствуют крупные зеленые, красные и бурые листья.

Нами установлено, что комплекс фенольных соединений, содержащийся в бадане, состоит из арбутина, дубильных веществ, флаваноидов, кумаринов. Результаты исследования по арбутину и флавоноидам бадана толстолистного опубликованы ранее [1, 2].

Целью настоящей работы являются качественное и количественное определение дубильных веществ, идентификация конденсированных танидов корневищ, зеленых, красных и бурых листьев бадана, подтверждение идентичности состава биологически активных соединений надземных и подземных вегетативных органов.

Дубильными веществами называют растительные полифенольные соединения с различной молекулярной массой. Они представляют собой сложную смесь близких по составу фенольных соединений, делятся на две большие группы: гидролизуемые и конденсированные.

Выделяют группы лекарственного растительного сырья, которые содержат только конденсированные или только гидролизуемые дубильные вещества или их смеси [3, 4]. Поэтому необходимо для каждого вида лекарственного растительного сырья устанавливать природу биологически активных соединений.

Экспериментальная часть. Объекты исследования – зеленые, красные, бурые листья и корневища бадана дикорастущего и культивируемого на территории Алтайского края и Республики Алтай: НИИ садоводства им. Лисавенко, ботанический сад АГУ, Майминский, Турочакский, Шеболинский и Чарышский районы. Сырье собирали в разные фазы вегетации 1999–2004 гг.

Для проведения качественного анализа дубильных веществ из воздушно-сухого сырья готовили водные извлечения 1 : 10 в соответствии с требованиями ГФ ХI издания [5].

Дубильные вещества, как и другие фенольные соединения, образуют окрашенные комплексы с солями тяжелых металлов, вступают в реакции сочетания с диазониевыми соединениями, дают осадки с высокомолекулярными веществами [3, 6, 7]. Количественное определение дубильных веществ проводили методом Левинталя-Курсанова и спектрофотометрически [8, 9].

В растительном сырье простые фенолы и фенолокислоты, которые входят в состав дубильных веществ, могут находиться и в свободном состоянии. Их количественное содержание определяли по следующей методике: 25,0 мл водного извлечения помещали в делительную воронку, прибавляли несколько капель раствора кислоты хлористоводородной, экстрагировали эфиром диэтиловым в течение 3 ч. Из полученного экстракта эфир отгоняли, остаток растворяли в теплой воде, количественно переносили в мерную колбу на 100,0 мл, доводя водой до метки. 10,0 мл полученного раствора титровали раствором калия перманганата в присутствии индигосульфокислоты. Таниды при извлечении свободных фенолокислот не переходят в эфирный экстракт, их количество определено по разности титрования исходного водного и эфирного извлечения.

Содержание конденсированных дубильных веществ устанавливали следующим образом: к 25,0 мл водного извлечения добавляли 0,5 мл концентрированной кислоты хлористоводородной, оставляли на 20 ч.

Осадок отделяли центрифугированием и титровали фильтрат. Разность между титрованием водного извлечения до и после удаления свободных полифенолов, фенолокислот соответствует содержанию конденсированных дубильных веществ.

Гидролизуемые таниды определяли по разности суммы дубильных веществ и конденсированных дубильных веществ.

Спектрофотометрическое количественное определение дубильных веществ проводили по следующей методике. Навеску сырья 2,0 г помещали в колбу и добавляли 250,0 мл воды очищенной. Экстрагировали при умеренном кипячении в течение 30 мин. Охлаждали, переносили в мерную колбу на 250,0 мл и доводили водой до метки. Предварительными исследованиями было установлено, что указанный режим экстракции обеспечивает достаточно полное извлечение танидов из лекарственного растительного сырья [10].

После экстракции часть извлечения (20,0 мл) центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. 10 мл центрифугата переносили в мерную колбу на 100,0 мл, добавляли 10,0 мл 2% водного раствора аммония молибденовокислого. Содержимое колбы доводили до метки водой очищенной, оставляли на 15 мин. Интенсивность образовавшейся окраски измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет танидов производили по стандартному образцу. В качестве стандартного образца использовали ГСО танина.

Для идентификации конденсированных дубильных веществ из зеленых, красных, бурых листьев и корневищ бадана получали спиртовое (95% этиловый спирт) и водное извлечения, проводили бумажную и тонкослойную хроматографию. В качестве стандартного образца использовали ГСО катехина [7–9].

Разделение осуществляли в системах растворителей бутанол – уксусная кислота – вода (БУВ) (40 : 12 : 28), (4 : 1 : 2), 5% уксусная кислота на бумаге марки «Filtrak» и пластинках «Silufol». Обнаружение зон веществ на хроматограмме проводили в УФ-свете, с последующей обработкой 1% раствором железоаммониевых квасцов или 1% раствором ванилина, концентрированной кислотой хлористоводородной [10–12].

Для спектрофотометрического определения зону вещества элюировали с пластинки «Silufol» 96% спиртом этиловым, снимали спектр поглощения в интервале 250–420 нм.

Для дальнейшей идентификации проведена ИК-спектроскопия. После хроматографирования зоны веществ элюировали 96% спиртом этиловым. Из элюата методом кристаллизации выделяли индивидуальные вещества. Подбирали растворитель, использовали абсолютный спирт этиловый и углерод четыреххлористый. Оптимальным растворителем явился углерод четыреххлористый. Исследуемое вещество растворяли в углероде четыреххлористом, наносили в виде тонкой пленки на диск натрия хлорида. Регистрация ИК-спектров фенольных соединений проводилась на ИК-спектрофотометре «Specord 75 IR».

Обсуждение результатов. В результате проведения качественных реакций установлено, что при взаимодействии с 1% раствором желатина появлялась муть, исчезающая от избытка реактива; с 1% раствором хинина гидрохлорида возникал аморфный осадок; с 1% раствором антипирина – аморфный осадок; с раствором железоаммониевых квасцов (ЖАК) – черно-синее окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества) и осадок; при добавлении смеси хлористоводородной кислоты и 40% раствора формальдегида после кипячения образовался осадок (конденсированные дубильные вещества); осадок отфильтровывали и к фильтрату добавляли раствор ЖАК и кристаллический свинца ацетат, получилось фиолетовое окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества); при добавлении 10% раствора кислоты уксусной, 10% раствора средней соли свинца ацетата образуется осадок (гидролизуемые дубильные вещества); осадок отфильтровывали, к фильтрату добавляли раствор ЖАК и свинца ацетат – черно-зеленое окрашивание (конденсированные дубильные вещества); в извлечение прибавляли натрия нитрат и 0,1 н кислоты хлористоводородной – бурое окрашивание.

На основании проведенных качественных реакций в исследуемых образцах обнаружено, что корневища, зеленые, красные и бурые листья бадана содержат смешанную группу дубильных веществ – гидролизуемые и конденсированные.

Далее устанавливали количественное содержание суммы дубильных веществ, количество конденсированных и гидролизуемых соединений.

Гидролизуемая группа составляла наибольшую часть суммы дубильных веществ бадана (более 90%).
Содержание дубильных веществ в зеленых и красных листьях соответственно 22,16 и 24,10%, из которых 21,22 и 22,43% гидролизуемые, 1,68 и 1,73% конденсированные; в бурых листьях и корневищах – соответственно 14,19 и 11,59%, гидролизуемые 3,28 и 10,19%, конденсированные 0,87 и 1,41%.
В ходе исследований по идентификации конденсированных дубильных веществ выявлена лучшая разделяющая способность ТСХ в системе растворителей (БУВ) (40 : 12 : 28).

Результаты проведения качественных реакций на дубильные вещества в извлечении корневищ,
зеленых, красных и бурых листьев бадана
Реактив Результат в извлечении из:
корневищ зеленых листьев красных листьев бурых листьев 1% раствор желатина Помутнение, исчезающее при добавлении реактива
Помутнение, исчезающее при добавлении реактива
Помутнение, исчезающее при добавлении реактива
Помутнение, исчезающее при добавлении реактива
1% раствор хинина гидрохлорида Аморфный осадок Аморфный осадок Аморфный осадок Аморфный осадок
1% раствор антипирина Аморфный осадок Аморфный осадок Аморфный осадок Аморфный осадок
Раствор ЖАК (без осаждения) Черно-синее Черно-синее Черно-синее Черно-синее
Раствор формальдегида Осадок Осадок Осадок Осадок
Фильтрат с 1% ЖАК Темно-синее Фиолетовое Синее Синее
Натрия нитрат Бурое Бурое Бурое Бурое

Результаты количественного определения дубильных веществ в зеленых, красных, бурых
листьях, корневищах бадана толстолистного (в пересчете на абсолютно сухое сырье)
Сырье Содержание дубильных веществ, %
сумма конденсированные гидролизуемые
Зеленые листья 22,16±0,07 1,68±0,11 21,22±0,09
Красные листья 24,10±0,03 1,73±0,32 22,43±0,31
Бурые листья 14,19±0,41 0,87±0,07 13,28±0,24
Корневища 11,59±0,37 1,41±0,01 10,19±0,35

Результаты проведения ТСХ водных извлечений бадана в системе растворителей БУВ (40 : 12 : 28) (окраска пятен в УФ свете):
Кн – корневища; З – зеленые листья; К – красные листья; Б – бурые листья; Кт – катехин

Результаты проведения ТСХ спиртовых извлечений бадана в системе растворителей БУВ
(40 : 12 : 28) (окраска пятен в УФ свете)
Водное извлечение из зеленых листьев бадана разделилось на 4 пятна, извлечение из бурых и красных листьев – на 3 пятна, корневищ – на 4 пятна
Пятно №1: Rf – 0,21, с 1% раствором квасцов железоаммониевых окрашивалось в темно-фиолетовый цвет, не проявлялось в УФ свете после обработки 1% раствором ванилина и парами концентрированной кислоты хлористоводородной.

Пятно №1': Rf – 0,43, с 1% раствором квасцов железоаммониевых – фиолетовое, не давало флуоресценции в УФ свете, не взаимодействовало с 1% раствором ванилина и с парами концентрированной кислоты хлористоводородной.

Пятно №2: Rf – 0,64, в УФ свете наблюдались желтая флюоресценция и окрашивание зоны вещества в темно-фиолетовый цвет при обработке 1% раствором квасцов железоаммониевых и красно-оранжевый цвет при взаимодействии с 1% раствором ванилина. Под действием паров концентрированной кислоты хлориcтоводородной и при нагревании до 105 °С наблюдалось желтое окрашивание зоны вещества (реакция отличия катехинов от лейкоцианидинов) [13, 14].

Пятно №3: Rf – 0,79, в УФ свете наблюдали зелено-голубую флюоресценцию, нет изменений при обработке другими реактивами.

Результаты ТСХ спиртового извлечения из корневищ бадана разделились на 5 пятен, из зеленых листьев – на 4 пятна, бурых и красных листьев – на 6 пятен.
Пятно №1: Rf – 0,24, в УФ свете фиолетовая флюоресценция и окрашивание в темно-фиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых.
Пятно №1': Rf – 0,26, в УФ свете оранжевая флюоресценция и окрашивание зоны вещества в темнофиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых.
Пятно №2: Rf – 0,48, в УФ свете желто-оранжевая флюоресценция и окрашивание в темно-фиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых.
Пятно №3: Rf – 0,64, в УФ свете лимонно-желтая флюоресценция и окрашивание в темно-фиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых и не изменялось с 1% раствором ванилина и в парах концентрированной хлористоводородной кислоты.
Пятно №3': Rf – 0,73, в УФ свете голубая флюоресценция и окрашивание в темно-фиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых.
Пятно №3'': Rf – 0,81, в УФ свете красно-оранжевая флюоресценция, окрашивание в темно-фиолетовый
цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых и красно-оранжевое окрашивание после обработки 1% раствором ванилина, не изменялось под действием паров концентрированной кислоты хлористоводородной.
Пятно №4: Rf – 0,97, в УФ свете красная флюоресценция, окрашивание в темно-фиолетовый цвет после обработки 1% раствором квасцов железоаммониевых и красно-оранжевое окрашивание после обработки 1% раствором ванилина. При взаимодействии с парами концентрированной хлористоводородной кислоты и последующем нагревании наблюдалось желтое окрашивание зоны вещества (отличие катехинов от лейкоцианидинов).

После хроматографического анализа спиртового и водного извлечения из зеленых, красных, бурых, листьев и корневищ бадана выявили пятно со сходными характеристиками в водном извлечении – пятно 2, в спиртовом – пятно 4.

Для спектрофотометрического определения зону вещества 4 элюировали с пластинки «Silufol» 96%
спиртом этиловым, снимали спектр поглощения в интервале 250–420 нм. УФ-спектр исследуемого вещества с максимами поглощения при 272 и 380 нм. Параллельно снимали спектр ГСО катехина. Конфигурации спектральных кривых идентичны.

Для дальнейшей идентификации проведена ИК-спектроскопия. После хроматографирования зоны веществ элюировали 96% спиртом этиловым. Из элюата методом кристаллизации выделяли индивидуальныев ещества. Подбирали растворитель, использовали абсолютный спирт этиловый и углерод четыреххлористый. Оптимальным растворителем явился углерод четыреххлористый. Исследуемое вещество растворяли в углероде четыреххлористом, наносили в виде тонкой пленки на диск натрия хлорида. Регистрация ИК-спектров фенольных соединений проводилась на ИК-спектрофотометре «Specord 75 IR».

УФ-спектр катехина.htm В ИК-спектре обнаруживалась полоса поглощения в области 1600 см¹, соответствующая колебаниям связей С=С в ароматических группах, и полоса поглощения в области 818 см¹ [14].

По результатам качественных реакций, хроматографического анализа, УФ- и ИК-спектрофотометрического определения и анализа литературных данных идентифицировали катехин. Следовательно, конденсированные дубильные вещества в бадане состоят из катехина. Лейкоцианидины нами не обнаружены.

Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что таниды бадана толстолистного состоят из гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ. Гидролизуемая группа составляла наибольшую часть из суммы дубильных веществ бадана (более 90%).
Содержание дубильных веществ в зеленых и красных листьях соответственно 22,16 и 24,10%, из которых 21,22 и 22,43% гидролизуемые, 1,68 и 1,73% конденсированные, в бурых листьях и корневищах – соответственно 14,19 и 11,59%, гидролизуемые 13,28 и 10,19%, конденсированные 0,87 и 1,41%.
Максимальное содержание дубильных веществ отмечено в красных листьях бадана, сумма составила 24,1%, из них гидролизуемые – 22,43% и конденсированные – 1,73%.

Из качественных реакций, хроматографического анализа, УФ- и ИК- спектрофотометрического определения и анализа литературных данных следует, что конденсированные дубильные вещества состоят из катехина. Лейкоцианидины не обнаружены.

Установлено, что по качественному составу дубильных веществ зеленые, красные, бурые листья и корневища бадана идентичны.

Список литературы:
1. Федосеева Л.М., Тимохин Е.А. Изучение флавоноидов листьев бадана толстолистного, произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 81–84.
2. Федосеева Л.М. Анализ арбутина подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного, произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 73–77.
3. Химический анализ лекарственных растений / Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. М., 1983. 175 с.
4. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 214 с.
5. Государственная фармакопея СССР Х1 издания. Вып. 2. М., 1990. 397 с.
6. Запрометов М.Н. Фенольные соединения. М., 1993. 358 с.
7. Исламбеков Ш.Ю., Каримджанов А.К., Мавлянов С.М. Растительные дубильные вещества // Химия природных соединений. 1990. №3. С. 293–307.
8. Кемертелидзе Э.П., Явич П.А., Сарабунович А.Г. Количественное определение танина // Фармация. 1984. №4.С. 34–37.
9. Хворост О.П., Беликов В.В., Сербин А.Г., Комиссаренко Н.Ф. Сравнительная количественная оценка содержания дубильных веществ у Alnus glutinosa (L.) Gaertn. // Растительные ресурсы. 1986. Т. 22. Вып. 2. С. 258–262.
10. Федосеева Л.М. Расчет эффективности процесса экстракции бурых листьев бадана толстолистного // Химия растительного сырья. 2000. №1. С. 117–119.
11. Хроматография. Практическое приложение метода: Пер. с англ.: В 2 ч. / Ш. Чармс, Л. Фигибейн, Дж. Вагман и др. М., 1986. 422 с.
12. Шаль Э. Хроматография в тонких слоях. М., 1965. 375 с.
13. Kindl H. Conversion of (4-3H) L-phenylalanine into (4-3H) pyrocatechol and (3-3H) hydroquinone in leaves of Bergenia crassifolia // Planta med. 1999. Bd. 15. №1. S. 35–39.
14. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1997. 236 с.
15. Жумабаева С.Е., Самородова-Бианки Г.Б., Стрельцина С.А. Фенольные соединения видов Microcerasus Webb, Armeniaca Scop. и Prunus L. // Растительные ресурсы. 1993. Т. 29. Вып. 3. С. 79–82.
16. Ковалев И.П., Титов Е.В. Инфракрасные спектры поглощения природных соединений: флавоноиды, полосы поглощения карбонильных и гидроксильных групп // Журнал органической химии. 1993. Т. 33. Вып. 5. С. 16–70.
17. Haslam E. (+)-catechin-3-gallate and a polymeric proanthocyanidin from Bergenia species // Lynn. Soc. 1969. V. 21.№1. P. 54–61.
18. Treutter D. A new HPLC technigue with a selective clinical reaction detection of catechins and condensed tannins //Planta med. 1990. V. 56. №6. P. 578.